开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
超低分子量肝素（ULMW）是硫酸化的聚糖类物质，临床用于治疗血栓性疾病。超低分子量肝素分子量从1500到3000道尔顿，相对应的是含有5到10个糖单位。商品化的药物Arixtra（黄达肝素钠）是一种结构均一，经过较长化学步骤合成的超低分子量肝素戊多糖。我们从简单二糖起，经过10～和12～步化学酶合成方法，合成两种结构均一的超低分子肝素（分子量为1778.5和1816.5），最后各自的总产率分别是45%和37%。兔子模型实验显示，这些ULMW肝素表现出很好的体外抗凝血活性，同时有可以和Arixtra相提并论的药代动力学特性。化学酶途径是可控的，显现出一个更加有效的合成该类重要药物的途径。
肝素是一种由艾杜糖醛酸（IdoA）或葡萄糖醛酸（GLcA）和葡萄糖胺（GLcN）残基组成的双糖重复单元，每一个都有携带磺酸基的能力。磺酸基团和艾杜糖醛酸（IdoA）残基的位置对于肝素的活性十分重要。肝素和HS有相似的双糖重复单元；然而，肝素携带更多的磺酸基团和更高水平的艾杜糖醛酸（IdoA）残基，它是自然来源分离得到的聚糖类中具有最强的抗凝血活性。HS聚合酶使用葡萄糖醛酸（GLcA）和N-乙酰氨基葡萄糖的双糖重复单元合成其骨架。其后的修饰依赖于磺酸基转移酶和异构酶。化学酶方法，依赖于一系列硫酸乙酰肝素生物合成酶，模拟肝素和硫酸乙酰肝素（HS）的生物合成。我们关于ULMW肝素的合成包括骨架延伸和单糖修饰。二糖3用来作为起始原料，因为它能被糖基转移酶延伸，也能从发酵得到的肝素前体大量制备。糖3到糖4的延伸使用两种细菌糖基转移酶完成，大肠杆菌coliK5的N-乙酰葡萄糖胺转移酶和巴氏杆菌的肝素前体合成酶-2（pmHS2）。糖4用非自然单糖GlcNTFA(N-三氟乙酰氨基葡萄糖)设计，因为在最后一步N-TFA基团能被稳定的转变成N-磺酸基团。
经济合理制备肝素的途径是十分重要的，不仅保证肝素供应链安全，而且提供一个设计降低副反应诱导药的机会。尽管我们化学酶合成途径，是合理的优化法，为制备不同肝素包括：ULMW肝素，LMW ，UF提供一个普通的方法。然而酶底物专一性限制目标选择，类如Arixtra寡聚糖，因为pmHS2不能有效延伸葡萄糖单糖，使之很难制备。尽管有障碍和缺点，我们的化学酶方法有利于用更短途径可扩展合成更大的目标。进一步的优化使这个方法适应大规模工业化合成是十分需要的。
1.乙酰氨基葡萄糖转移酶的构建
1.1 KfiA基因来自E.coliK5 strain基因组DNA,根据目的基因设计引物，通过两个引物进行PCR扩增。
PCR反应体系：
模板 13.5ul
引物I 0.5ul
引物II 0.5ul
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