基于线粒体基因组的正蚓科蚯蚓系统进化研究
- 蚯蚓的分类学研究概况
陆栖寡毛类即我们通常所说的蚯蚓，是重要的土壤生物类群，是陆地生态系统中生物量最大的动物，具有重要的生态功能。它们参与土壤结构的形成，促进土肥相融，在改善土壤结构，通气、排水、渗透能力方面起着十分重要的作用，并且具有协同微生物促进土壤有机质的分解和矿化的功能，影响陆地碳汇[1, 2]。在分类学上，蚯蚓属于无脊椎动物（Invertebrate），环节动物门（Annelida），寡毛纲 (Oligochaeta) 的单向蚓目 (Haplotaxida) 和正蚓目 (Lumbricida)。全球已记录蚯蚓有20科，约6000种，其中陆栖蚯蚓有12科，181属，约5000种[3, 4]， 巨蚓科 (Megascolecidae) 、正蚓科 (Lumbricidae) 和真蚓科 (Eudrilidae) 是陆生蚯蚓中发展最广的类群, 也是已知的最大类群。中国陆栖蚯蚓分类研究自1872年开始。截至2017年，我国已记录有陆栖蚯蚓共9科28属640种（含亚种）[5-8]。中国的蚯蚓多样性十分丰富，仅次于澳大利亚，其中巨蚓科 (Megascolecidae) 蚯蚓以82.8%的比例成为绝对优势类群，其次是正蚓科 (Lumbricidae) 和链胃蚓科（Moniligastridae），分别占7.5%和5.7%，而寒蚓科（Ocnerodrilidae）、八毛蚓科（Octochaetidae）、综族蚓科（Almidae）、沙蚓科（Glossoscolecida）和棘蚓科（Acanthodrilidae）的生物多样性却很匮乏[7]。
正蚓科（Lumbricidae）是我国北方地区分布广、数量多的一类重要药用及经济寡毛动物[9]。刚毛单尖，对生，通常呈“S”字形，前几节的交配毛末端有隆脊及沟，通常位于突出的乳突上。雄性生殖孔通常在第15节上或很少在第14节上[10]。雌性生殖孔通常在第14节上。由于正蚓科动物在形态特征上的区别不明显，特别是在某些种类中间往往还有多个变种或亚种，仅以传统分类方法根据它们与模式种形态特征的某些细微差异而确定常常难以鉴别，分类定种具有极大困难。因此，采取一些先进的方法借助生物化学方法鉴别物种，并从分子水平探讨正蚓科各类群之间的亲缘关系和分类地位是很有必要的[9]。
- 动物线粒体基因组研究
线粒体是细胞内氧化磷酸化和形成ATP的主要场所，是真核生物能够呼吸的必需细胞器，细胞所需能量的95%是由线粒体提供的，同时线粒体也具有细胞其他的生化功能[10]。线粒体含有其自身的基因组及与复制、转录和蛋白合成有关的元件，这些行为和遗传学特征表明线粒体又是一类特殊的半自主性细胞器。线粒体的起源和进化研究一直是现代生物学的热点研究问题。在系统发生上，普遍认为线粒体细胞器是通过内共生而起源的[11]。
2.1 动物线粒体基因组的大小及基因排列变化
动物线粒体基因组（animal mitochondria genome，mtDNA）一般为母系遗传，基因内通常不含内含子，结构紧凑，基因排列紧密，基因间序列非常短甚至没有，通常含1~2个主要的非编码控制区（又叫CR或D-loop区），绝大多数为环状DNA分子，但也有极少数物种是线性mtDNA[12, 13]。根据氯化铯密度梯度离心中的密度差异, DNA双链可分为重链 (H-链) 和轻链 (L-链) 。后生动物线粒体基因组一般包含37个基因：2个线粒体rRNA基因，13个蛋白编码基因和22个线粒体专一性的tRNA基因，以及调节复制和转录的控制区（control region，CR），该区在脊椎动物中又称取代环区（displacement loop或D-loop区），其中除ND6和8个tRNA基因由L-链编码外, 其余基因都由H-链编码，序列总长主要分布在15~19kb之间[14]。动物线粒体基因组的大小变化差异很大程度上是由于mtDNA非编码区部分序列复制、内含子以及基因间隔区而导致的[15]。在无脊椎动物和冷血脊椎动物中mtDNA的大小变化相对来说比较频繁，甚至出现于同种的不同个体之间[16]。总体上看，脊索动物门、棘皮动物门、节肢动物门和扁形动物门基因组大小较为稳定，而软体动物门、线虫动物门和海绵动物门的基因组大小表现出较强的异质性[17]。
基因的排列次序是研究物种系统发生关系的一种理想模型。基因次序变化研究主要有基因的缺失和重复、基因的正负链转移、基因的调换、相邻基因的转换（也称基因倒置）等。在所有的基因次序变化类型中,最简单的是基因在正负链转移的问题。低等动物由于其种类繁多,而目前的测序大部分集中在脊椎动物上,缺乏足够的线粒体基因组数据,因而在负链编码的基因目前并没有明显的规律。而在脊索动物门的线粒体基因组中,在负链上编码的基因主要有9 种,包括tRNA编码基因8 个( trn A、trn C、trn E、trn N、trn P、trn Q、trn S、trn Y ) 和1 个蛋白编码基因ND6[18]。随着测序技术的不断发展,越来越多的物种的线粒体基因组被测序。在线粒体基因组基因结构和表达机理方面，原生动物变化较为显著；而在遗传学功能方面，原生动物和后生动物变化均非常保守[16]。大多数亲缘关系较近的动物线粒体基因排列的次序也趋于一致,而亲缘关系越远的线粒体基因次序之间差异也越大[19]。
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- 线粒体基因组在动物系统发育研究中的应用
动物线粒体基因组作为完整的细胞器基因组具有简化的环状结构和相对保守的编码基因内容，是最容易测序和注释的细胞器基因组[20]。与单个基因相比，线粒体基因组不仅包含的信息量更大，而且可提供一整套基因组水平的特征，例如基因含量和基因排列、碱基组成、复制和转录的模式、tRNA和rRNA的二级结构以及遗传密码变异等[17, 21]。由于mtDNA基因组小、进化快速、世代传递过程中一般没有重组及为母系遗传等特点，mtDNA已成为比较遗传学和系统发生学研究的理想工具， mtDNA的多态性分析已广泛用于与动物相关的多个研究领域，如个体识别、物种鉴定、亲子鉴定等[14, 22]。近十年来，基于线粒体基因组结构（如基因重排、重复序列、内含子的插入或缺失等）的系统发育分析已成为动物物种分类和进化研究的热点。
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- 蚯蚓线粒体基因组的研究现状
蚯蚓个体小、形态特征少等特点一直是阻碍蚯蚓分类学研究发展的问题，随着基因测序技术的快速发展及分子分子生物学的方法的引入，蚯蚓分类学研究得到了有效的完善。目前仅有陆正蚓（Lumbricus terrestris）、缅甸巨蚓（Tonoscolex birmanicus）、掘穴环爪蚓（Perionyx excavatus）三种蚯蚓的mtDNA全序列被测定[23]。Dominguez等使用28S、18S、16S、12S、ND1与COⅡ等线粒体基因构建了128个正蚓科物种的系统发育树，并将其与形态学特征结合分析[24]。孙静等使用COⅠ、COⅡ、ND1、12S、16S等线粒体基因以及18S核基因，以及联合基因的序列，对我国143个蚯蚓物种进行了分子系统发育研究，结果显示，联合基因对蚯蚓分类阶元中的纲以下阶元分类具有较为准确的分类意义[25]。赵琦、孙静、蒋际宝分别提取百余个巨蚓科物种线粒体蛋白编码基因COⅠ、COⅡ、ND1、12S、16S基因以及18S核基因等，初步阐明了我国巨蚓科蚯蚓的系统发育关系：研究一致显示，基于COⅠ、COⅡ、ND1、12S、16S等联合序列建立的蚯蚓分子系统发育树可靠性显著高于单基因或少数几个基因构树[7, 8, 25]。
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