基因编辑技术在基因敲除研究中的应用
摘要：基因编辑技术是生命科学研究的重要内容，本文对CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、NgAgo、SGN几种新型基因编辑技术从构成，适用范围以及优缺点作了简单的介绍。CRISPR/Cas9系统展现出很强的基因编辑能力，是一项极具有应用潜质的新技术。因此着重论述了CRISPR/Cas9在植物、动物、细菌基因敲除研究中的应用，对该技术的影响因素以及可行性进行了分析，旨在为生命科学研究领域研究人员提供参考。
关键词：基因编辑技术； CRISPR/Cas9应用； 基因敲除
文献综述
基因编辑技术是在基因组水平进行基因定点插入或缺失突变、敲除、多位点同时突变和小片段删除等精确操作的技术，是生命科学领域的重要研究内容，但在对生物基因组进行定向修饰时，该技术的打靶效率低，试验周期长，应用范围窄使对生命科学的研究受到了阻碍。随着基因编辑技术的不断发展，新型基因编辑技术通过特异识别并且裂解靶DNA双链，激发细胞内源性修复机制实现基因定向改造，提高了打靶效率，且构建成本低，应用范围广，促进了生命科学的研究进程[1]。基因敲除又叫做基因打靶，是从分子水平去除或替代一个基因，通过观察实验动物的表型，以此推测该基因的功能。利用基因敲除建立的疾病模型，通过研究动物发育过程中各个基因的功能，成为研究治疗遗传疾病的途径[2]。
基因编辑技术研究进展
CRISPR/Cas9
CRISPR/Cas9也叫作RNA导向打靶系统，能够完成RNA导向的DNA识别以及编辑，提供了更高效的基因定点修饰技术平台。 CRISPR/Cas9由tracrRNA、crRNA与Cas9蛋白酶三部分组成, 需要tracrRNA序列与crRNA结合成复合物发挥识别作用。其作为一项新型基因编辑技术，已经在细胞水平和个体水平上得到了广泛的应用，尤其在各种重要的模式生物(如线虫，果蝇，斑马鱼，小鼠，大鼠， 猴子等），显示出了强大的基因编辑能力。但是，由于在设计sgRNA时受到特异性位点的限制和某些物种复杂的基因结构，该技术还面临着脱靶效应、细胞毒性、基因插入困难等问题，在一定程度上限制了CRISPR/Cas9技术的应用[3]。
CRISPR/Cpf1
Cpf1是一种新型CRISPR效应蛋白,与Cas9相比，具有许多不同的特性,有利于克服CRISPR/Cas9应用中的一些限制。Cpf1蛋白酶被发现可以编辑靶基因, 且序列更简单、高效最重要的是脱靶效应几乎没有，效率获得了突破性的提高。 CRISPR/Cpf1由crRNA与Cpf1蛋白酶两部分构成, 不需要tracrRNA序列，通过减小gRNA的序列，减轻了针对靶序列的gRNA的设计工作, 而且在一定程度上提高了该系统的转染效率。Cpf1酶分子量小，更容易进入细胞，可以提高编辑成功率。该系统切割靶位点产生的黏性末端, 引起较大基因片段的缺失与插入, 这在一定程度上增加了编辑靶序 列的可塑性[4]。
NgAgo
NgAgo 技术一种新的基因编辑工具。NgAgo是一种耐热古细菌的 Argonaute( Ago) 蛋白的简称。 Ago 同源蛋白具有核酸酶活性，可以在RNA或DNA的引导下，切割外来的基因或质粒。但因为只能在高温下工作，该系统不能应用于一般生物细胞的研究。 经过多次实验证明NgAgo不能进行基因组编辑，但能在DNA 引导下，作为核酸内切酶切割RNA被认为可能是一个很方便的基因敲降工具[5]。经研究发现，NgAgo 技术 gDNA 设计方便，编辑对象所受限制小，几乎能编辑基因组内任何位置，同时编辑精准度较高。但目前NgAgo 技术还存在无法使用质粒或慢性病毒载体输送gDNA且gDNA不能再改造等问题，还需要后续工作进行进一步的改进[6]。
SGN
结构引导的核酸内切酶(SGN)是由Xu等创新性的把翘尾核酸内切酶1(FEN－1)与 TALEN 中使用的FokI的切割结构域(Fn1)结合成为该种重组核酸内切酶。SGN通过一个向导 DNA( gDNA)与目标DNA配对，可以识别gDNA的翘尾结构，并对 DNA双链进行切割，因此SGN及gDNA 需要成对使用。经过对斑马鱼基因编辑的研究发现该技术的编辑效率较低，且编辑去除的序列长度不受控制，因此作为一种基因编辑工具，其并不受到广泛的信赖。因此，该技术还需要进一步的研究和完善，提高其可控性才能广泛应用于生物学研究领域[5]。
CRISPR/Cas9系统介导的基因敲除研究
CRISPR/Cas9系统在介导基因敲除研究中的应用
在CRISPR/Cas9基因编辑技术取得进展之后，其迅速被应用于人类、大鼠、小鼠、斑马鱼等模式动物的基因编辑研究中。哈佛医学院的P．Mali等[7]利用CRISPR/Cas9系统成功对人类诱导多潜能干细胞的AAVS1位点进行打靶。在斑马鱼中，H．Wang 等人分别构建了针对 fh 基因的sgRNA和编码Cas9的T7启动子表达载体，通过显微注射的方式成功在斑马鱼胚胎中实现了特定 DNA 位点的切割,且研究了其功能。W．Li［8］利用CRISPR/Cas9技术，首次在大鼠上实现了多基因同步敲除。D．Li 等［9]，也利用CRISPR/Cas9技术获得了基因敲除大鼠。
CRISPR/Cas9系统在拟南芥，烟草，水稻，玉米，高粱，大麦，甜橙和番茄等多个植物物种中可以进行高效的基因编辑。经研究发现，CRISPR/Cas9系统利用农杆菌侵染方法稳定转化拟南芥和水稻，突变效率有所提高，表明了该系统可以有效地诱导水稻中目标基因的编辑，而且利用CRISPR/Cas9系统可在水稻原生质体实现染色体大片段的删除[10]。
CRISPR/Cas9系统还可以对肺炎双球菌，大肠埃希菌以及链霉菌属的多个菌种进行 基因编辑。研究表明CRISPR/Cas9系统有可能在构建新一代工程菌的过程中起到关键作 用，但是细菌很难修复 CRISPR造成的损伤[11]。
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