一、研究背景及选题依据
1. 研究意义及社会应用前景
真核系统的优势：
重组基因工程蛋白质类药物以成为当今人类抵御疾病的重要手段之一。基因工程药物的开发与应用蕴藏着巨大的社会价值及商业价值。以大肠杆菌为基础的原核表达平台生产了大量的重组蛋白类药物，为整个产业发展做出了巨大贡献。但原核表达系统致命的缺陷在于缺乏重要的翻译后修饰能力，使的很多蛋白分子不能形成正确的空间构象以发挥其应有的效能，同时还可能引起不必要的副反应。这种先天性缺陷阻碍了许多蛋白质药物的发展和应用。以哺乳动物细胞为基础的真核表达系统有着与人类细胞几乎相同的翻译后修饰功能，是基因工程蛋白质药物理想的表达平台。有资料统计从2006年到2010年，FDA批准的58个生物药物中：2个为昆虫表达系统、3个为转基因动物表达、4个为酵母表达、17个为大肠杆菌表达，而哺乳动物细胞表达占到了32个，占绝对优势地位[1]。在众多的真核表达细胞中，CHO（中国仓鼠卵巢细胞）是目前产业化程度最高的细胞之一。其效能和安全性得到了广泛的认可，优良的悬浮培养特性可适应大规模生物反应器的应用，具有良好的产业化前景。
制约CHO系统发展的因素 ：
但目前我国CHO细胞的应用与大肠杆菌比起来还未达到应有的水平。原因在于我国自主研发的CHO工程细胞株与国外同类产品相比特异性产物的表达水平偏低，长时间培养条件下稳定性不高，存在产量退化的风险。这种低产量低稳定性与大规模生物反应器的高成本相矛盾，抑制了资本投入。另一方面CHO工程细胞株的研发与大肠杆菌相比周期长、成本高、获得高表达细胞株的几率低，从而在一定程度上抑制了科研投入。
造成这种局面的问题在于建立在随机整合基础上的传统加压筛选方案无法满足产业化对高表达细胞株的需求。典型的加压筛选的机理是利用含编码二氢叶酸还原酶（DHFR）序列的外源目的基因片段转染DHFR缺陷型CHO细胞。在DHFR抑制剂氨甲蝶呤（MTX）浓度逐级提高的选择性压力下，携带DHFR序列的外源基因片段拷贝数不断扩增，并随机整合宿主染色体，从而得到高表达水平的细胞株。但问题在于逐级加压过程一般需要耗费数月时间，基于稀释法的单克隆筛选更是加大了工作量。染色体的随机整合给宿主细胞的成活造成了严重的威胁，并且大部分整合位点属于低表达活性区域。产业化过程中由于选择性抑制剂的撤销，外源基因整合拷贝数越低的细胞生长优势越高，使得整个细胞群体表达量下降。
解决思路：
造成上述问题的根源在于外源基因的染色体随机整合现象。本课题拟采用锌指核酸酶（zinc-finger nucleases ZFN）和特异性大片段整合酶技术使外源基因特异性整合于CHO细胞染色体的特定区域，在实现高表达的同时尽量降低对宿主的副作用。特异性整合与特异性敲除相结合，赋予宿主细胞新特性。完全摒弃MTX加压的过程，消除细胞表达产量退化现象。以特异性整合替代随机整合，提高高产细胞株筛选几率。
社会应用前景：
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