谷氨酸脱羧酶的重组表达、酶学定性及初步应用
1.谷氨酸脱羧酶概述
谷氨酸脱羧酶(Glutamatedecarboxylase,简称GAD，EC4.1.1.15)，是在辅酶磷酸吡哆醛（PLP）的辅助下催化谷氨酸或谷氨酸钠脱羧生成GABA，它是一种磷酸吡哆醛酶,PLP可调节GAD处于活性或非活性状态的转变[1]。微生物具有易培养、传代快和分布广等特点，是生物GAD酶的重要来源。不同来源的GAD具有较大的差别。哺乳动物神经系统会产生GAD65和GAD67两种同工酶，主要用来合成抑制性神经递质GABA.控制脑细胞信号活动。植物组织中的GAD活性受C末端的Ca2 /钙调节蛋白的调节,GAD活性和GABA合成参与植物的应激反应。在微生物中，GAD通过耐酸系统来维持细胞生理pH,抵抗酸性环境，其中以Ecoli的GAD研究最为深入。
2.谷氨酸脱羧酶在大肠杆菌中的重组表达
谷氨酸脱羧酶是GABA生产中的关键酶，可以通过基因重组技术的应用使酶的产量明显提高。重组大肠杆菌可以高效催化合成gamma;-氨基丁酸，为基因工程菌工业化制备GABA提供实验依据。目前在基因工程领域，重组蛋的原核白表达的系统主要有大肠杆菌表达系统以及逐渐完善的枯草芽抱杆菌表达系统、短小芽孢杆菌表达系统及新兴的乳酸菌表达系统，真核中则有在微生物领域的酵母表达系统等等。其中大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛、研究最透彻的基因工程表达系统，尤其是其ｐＥＴ系统在大肠杆菌表达系统中占据十分重要的地位[2-3]。大肠杆菌表达系统也有一定的缺陷，除大肠杆菌自身安全性的隐患外，大肠杆菌表达外源蛋白表达速度比较快，量高，蛋白常常来不及折叠，常形成大量不溶性的无活性的包涵体，对蛋白酶活会造成严重的影响，所以在大肠杆菌保证菌体快速生长的前提下，应提高外源重组目的蛋白的可溶性表达。目前，随着对大肠杆菌遗传表达系统机制的研究进一步的深入透彻，生物分子技术手段的进一步创新，相对应的仪器设备更新换代，可以提高重组蛋白可溶性表达的策略己经有很多。可以通过构建基因工程菌 E.coli GAD，实现来源于基因组中gad基因的高效功能表达[4]。同时，对催化反应条件进行优化，反应的最适pH值和温度分别为 pH 4.5 和 35 ℃，当谷氨酸浓度为200mmol /L 时，最适的细胞浓度为8 mg /mL，在 2 h 内可以完全转化底物为gamma;-氨基丁酸。可以发展一种分批补料催化反应策略，目的在于提高反应液中gamma;-氨基丁酸的浓度，达到 247 g /L。采用基因工程策略，构建高效的基因工程菌，实现谷氨酸向高附加值gamma;-氨基丁酸的转化，对提升氨基酸发酵产业升级具有一定的促进作用。
3.谷氨酸脱羧酶制备应用及研究现状
3.1谷氨酸脱羧酶制备gamma;-氨基丁酸
3.1.1 gamma;-氨基丁酸概述
gamma;-氨基丁酸( gamma;-aminobutyric acid，GABA) 是一种普遍存在于自然界中的非蛋白质类的氨基酸，它可由谷氨酸或其钠盐经谷氨酸脱羧酶（GAD）在一些辅因子的辅助下催化转化而来。GABA在常温状态下是一种针状晶体或以白色薄片的形式存在[5]；在水中的溶解度较大，可以微量溶于热乙醇；在温度大于202℃时，gamma;-氨基丁酸会被熔化并分解生成水和吡咯烷酮。在1975年第二次国际GABA研讨会上，经大会讨论，GABA被正式证明是一种类似于去甲肾上腺素的抑制性神经递质物质。近年来, GABA的相关研究变得越来越热门, 2009年卫生部批准其为新资源食品, 它将会成为21世纪新资源食品的生产原料之一［6－7］。
3.1.2 gamma;-氨基丁酸的制备
GABA天然存在量很低，很难从天然组织中大量分离，阻碍了它的工业生产。目前，GABA 的制备方法有化学合成法、植物富集法和微生物合成法。相比而言，化学合成 GABA 安全性差、环境污染严重，植物富集 GABA 含量较低，而微生物合成生产法因具有条件温和、成本低，能耗低，产量高等优点而成为主要的生产方法。
微生物发酵法是利用微生物体内的GAD催化 L-谷氨酸或 L-谷氨酸钠盐脱去羧基生成 GABA。方法主要分为两种类型，一种是利用自身具有 GAD 编码基因的微生物进行发酵，通过向发酵液中外源添加L-谷氨酸或 L-谷氨酸钠盐，使微生物自身合成的 GAD发生催化作用生成GABA，微生物种类多为高 GAD活性的大肠杆菌（Escherichia coli）或乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）；另一种是利用自身合成 L-谷氨酸的微生物，在微生物体内表达外源 GAD蛋白，使L-谷氨酸经催化反应生成GABA，微生物种类一般为谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）。随着基因工程的发展，重组大肠杆菌、乳酸杆菌和谷氨酸棒杆菌等已被用于gamma;-氨基丁酸合成的研究中，GAD 在宿主细胞中的高效表达，从而实现 GABA 的高效制备［8-9］。该方法的优点是反应温和，GABA 能够大量合成，适用于工业化生产，并且使用GRAS 菌株（Generally Recognized as Safe）生产的GABA 能够用于食品和医药行业中，因此微生物发酵法也成为GABA生产研究的热点方法。其中利用C. glutamicum发酵生产GABA的方法免除了发酵中外源添加L-谷氨酸或L-谷氨酸钠盐的步骤，使发酵过程一体化，操作简便，提高生产效率的同时减少了外源污染的机会，因此此方法的相关研究越来越受到关注。
但不足的是由于大肠杆菌的限制，使得通过制备得到的GABA很难应用在食品工业中[10]。虽然乳酸杆菌（包括植物乳杆菌、短乳杆菌等）是生产GABA的最主要菌株之一［11-12］。其催化生产安全性高，但其天然GAD活力较低，发酵培养困难、成本高、GABA 产量低。为了提高乳酸菌催化合成 GABA能力，KOOK 等［13］将 L. plantarum ATCC 14917 GAD基因通过穿梭载体pTＲKH2导入到 L. sakei B2-16 中。重组菌L. sakei B2-16的GABA 产量 265. 3 mmol /L，比原始菌提高了1. 42倍。
3.1.3 gamma;-氨基丁酸的应用
近年来，富含GABA产品的发展越来越迅速，逐渐成为研究的热点。纯天然药物的开发与目前的＂药食同源＂的趋势相统一，因此GABA在未来社会各行业中也将有广泛的使用。从那时起，食品级的GABA在＂民以食为天＂的传统下，它的降低压力，辅助睡眠等功能将有利于在当今严重的社会压力下工作的工作者们，帮助他们改善焦虑情绪，减轻工作压力目前，GABA在食品业的主要产品有：苏巧水、果酒、保健酒等功能性饮料。在奶制品行业有利用乳酸菌生产的GABA作为食品添加剂，具有降血脂作用同。在医药应用方面，我国含有GABA的药品主要是gamma;-氨基丁酸片和gamma;-氨酪酸注射液。
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