毕业论文课题相关文献综述
1.1.1脂肪酶概述
脂肪酶（1ipase,EC3.1.1.3）即三酰基甘油酰基水解酶，是一种特殊的酯键水解酶，它可以在油水界面上催化油脂的水解反应，生成脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯[1]。脂肪酶通常被用于在非水相体系中催化油脂及其它一些水不溶性酯类的水解、醇解、酯化、转酯化以及酯类逆向合成等反应[2-4]。由于其高效专一、反应条件温和等特点，已有越来越多的脂肪酶在油脂加工、造纸、食品、医药和日化等行业中得到应用[5]。
在自然界中，脂肪酶广泛地存在于植物，动物及微生物等生物体中。与来自于植物和动物的脂肪酶相比，微生物的脂肪酶（主要来自于细菌和真菌），种类繁多，催化活性高，易于基因操作，稳定性高，生产方便且安全，产量高等优点[6]，因而在生物工业和有机化学领域应用非常广泛[7]。其中，以来源于pseudomonas的脂肪酶为典型代表[8-10]。一些重要的工业用酶也已经从植物体中分离出来，如羟裂合酶（HNLS）。另外，一些常用的工业用酶也有从动物体内的脂肪组织和胰脏获取，如从猪胰中分离的PPL。
1.1.2 枯草芽孢杆菌脂肪酶A简介枯草芽孢杆菌脂肪酶A（简称BSLA）是由枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）分泌产生的一种胞外水解酶。编码BSLA的lipA基因位于B. subtilis基因组291,800 bp处，结构基因全长为 636 bp，编码212个氨基酸，这些氨基酸组装成的脂肪酶前体。BSLA前体在后加工过程中去掉31个氨基酸的信号肽，得到的181个氨基酸组装折叠成BSLA，其分子量仅为19kDa。研究发现，与其它微生物脂肪酶不同，BSLA没有保守的五肽结构：Gly-X-Ser-X-Gly，取而代之的是Ala-X-Ser-X-Gly， Ala取代了保守五肽序列第1位的Gly，并且这种取代并没有引起亲核区域的主链构象发生较大的改变。
1.1.3BSLA的催化机理
脂肪酶与丝氨酸蛋白酶催化机理相似[15]，其催化反应机制均为乒乓类型（bi-bi）[16,17]。与绝大多数的细菌脂肪酶不同，BSLA活性中心上没有盖子结构，其活性中心的疏水结构直接暴漏在溶剂中，因此不存在界面激活效应。其催化过程如图1-4：当底物靠近其活性中心时，在活性中心附近的组氨酸的参与下，活性中心的丝氨酸残基被激活，丝氨酸残基羟基上的氢原子转移到组氨酸的咪唑环上，丝氨酸残基的羟基氧原子对已被激活的底物羰基碳原子发起亲核攻击。（见图1-4a）在丝氨酸残基羟基氧原子的作用下，羰基双键断裂，羰基氧原子携带上负电荷（阴离子氧）而羰基碳原子与4个其它原子键合，形成一个瞬间的四面体中间复合物（见图1-4b）。阴离子氧通过与两个肽键的-NH-基团相互作用而稳定，醇羟基的氧原子通过与组氨酸提供的质子氢相互作用而稳定。羰基碳原子继而发生螺旋扭转，形成一个螺旋状的大偶极，阴离子氧与另外两个肽键的-NH-基团之间形成氢键（阴离子氧洞）而组氨酸咪唑环上从丝氨酸羟基获得的质子氢被转移给酯键的醇羟基，酯键断裂，释放游离的醇，同时羰基与质子化的丝氨酸之间重新形成酯键，这样就形成了一个稳定的酰基-酶共价中间体复合物（见图1-4c）。继而，组氨酸残基的咪唑环将从丝氨酸获得的质子转移给酯键的醇羟基后，又从进入活性中心的水分子中夺取质子，从而激活了水分子水分子剩下的OH-离子攻击同丝氨酸羟基共价结合的底物羰基的碳原子，同时组氨酸再次将从水分子中获得的质子转移给丝氨酸的阴离子氧，释放游离的羧基化合物（见图1-4d）[18]。
1.1.4脂肪酶的应用
脂肪酶作为一种常用的食品改质剂，已被广泛地应用于面包、乳制品、酒类酿造、无脂肪酶的肉及食品包装材料等领域中。脂肪酶最早应用于分解油脂产生短链脂肪酸为加工食品的增香改质、提高食品档次，生产代可可脂[19]。
众所周知，为了提高洗涤剂的去污能力，洗涤剂中通常含有一种或多种酶作为增效剂，如淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶和脂肪酶[20]等。其中，碱性脂肪酶能够有效地将人体皮肤产生的脂肪类污垢(主要成分为甘油三酸酯)分解为易于除去的甘油、甘油一酯、甘油二酯、脂肪酸等物质，因而提高洗涤效果[21,22]。因此碱性脂肪酶被广泛地应用于洗涤剂行业。
脂肪酶还被应用于处理泄露的石油。鉴于海上时会发生石油泄漏事件，如不及时处理，一方面会造成海洋生物的大量死亡，另一方面也会通过食物链的富集作用危害人类生命安全。而使用含有脂肪酶的复合制剂处理泄漏的石油，既可以降解提供微生物养分，也可以有利于能够降解石油的细菌繁殖来降解石油[23]。除此之外，脂肪酶还可以用来处理餐饮行业中产生的餐饮废油(油酸及亚油酸)以及油脂工业产生的废油脂。
1.1.5脂肪酶热稳定性分子改造研究进展
BSLA为常温酶，其最适温度仅为35℃。热稳定性是评价工业生物催化剂的一个重要指标，工业上提高反应温度，可以提高转化率、底物可溶性、降低微生物污染的可能性等，因而提高酶的耐温性是酶工业化亟待解决的问题之一。传统酶分子设计常用的方法可以概括为理性设计、非理性设计。随着计算机性能不断提高，蛋白结构分析、生物信息学和计算生物学等一系列新理论和新技术不断发展和成熟，分子模拟和分子对接作为一种应用广泛的计算机辅助实验技术。2006年，Reetz研究团队在国际上率先提出一种称作迭代饱和突变(Iterativesaturationmutagenesis,ISM)的半理性蛋白质设计策略（semi-rationaldesign）[24]。ISM是以笛卡尔坐标系中蛋白质三维结构为基础，在定向进化的基础上加入了理性设计的元素，将随机突变限制在提高酶某一催化功能的几个预选位点上，进行多轮饱和突变的迭代循环，实现快速定向进化。在提高BSLA的热稳定性方面，Reetz等[24]采用B-FIT选出10个平均B值较高的位点进行常规的饱和突变操作，经第一轮饱和突变，A、B、D、E、F、G六个位点的突变体库中均有热稳定性较高的突变体，其中E突变体库中有突变体的T5015达到了54.3℃。接着以E中得到的突变体为模板分别对其B、D、E、G四个位点进行迭代饱和突变，最终得到突变体X和XI，其T5015分别达到了89℃和93℃。由此可见，迭代饱和突变在提高酶的热稳定性上较之传统方法表现出了极大的优越性。
1.2分子模拟软件
近年来，随着高性能计算的日益更新，分子模拟软件的发展也越来越完善。其中同源建模软件主要有：Prosa，BLAST等；分子动力学模拟软件主要有：GROMACS，AMBER，LAMMPS，CHARMm，NAMD等；分子对接软件主要有：AutoDock，DiscoveryStudio，Sybyl，MOE，Gold，Surflex，Glide，MVD，FlexX，Dock等；量子化学软件主要有：GAUSSIAN，MOPAC，MOLCAS等[25]。这些模拟软件已经广泛地被用于理解、预测、模拟蛋白质、核酸、糖类等生物大分子结构与功能等方面的研究，成为生物信息学的不可或缺一种重要的研究手段。下面主要介绍分子对接AutoDock与分子动力学GROMACS两种免费的软件基本概念。
1.3分子模拟技术在脂肪酶催化性能研究中的应用
随着高性能计算机技术及分子模拟软件的日益成熟，能够为处理各类蛋白的生物大分子的模拟提供了坚实的理论基础。分子模拟技术能够从分子水平提供理解蛋白的结构与功能的关系，使得酶的分子改造逐渐地从传统的非理性改造向理性改造过渡，为酶分子的理性改造提供了新的独特视角[38,39]。
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