开题报告
论文题目：
利用CRISPR-Cas9转录激活系统激活HEK293细胞中EGFR基因的表达
- 选题的目的和意义
传统的基因组编辑主要是通过能够靶向特定DNA序列的蛋白质实现，如Meganucleases，锌指蛋白（ZF），类转录激活因子效应物。这三者都是通过“DNA-蛋白质”的特异性结合来实现其靶向性，因此，需要设计蛋白质的结构来实现其对DNA的靶向，这一技术是存在难度的。然而，最近在微生物体系中发现的一种适应性免疫防御系统（CRISPR-Cas9），
其中，具有核酸酶功能的Cas蛋白是通过RNA介导靶向到特定的DNA位点。也就是说，针对不同的靶点，我们只需要设计不同的导向RNA即可，这大大提高了基因组编辑的可操作性和精确性，同时也为调控特定基因的表达提供了平台。另外，人们通过进一步的研究发现，通过对CRISPR-Cas转录激活系统进行改进，将其与多个转录激活结构域结合构建协同激活介质（SAM），大大提高了基因的表达水平，可以在活细胞中有效启动任何基因，让科学家更简便的研究不同基因的功能。改造后的CRISPR技术，可以快速对整个基因组进行功能筛选，帮助人们鉴定涉及疾病的基因。
研究表明在很多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖，血管生成，肿瘤侵袭转移及细胞凋亡的抑制有关，而EGFR的高表达主要与基因扩增有关。因此，本课题利用高效精确的CRISPR-Cas9转录激活系统激活HEK293细胞系中EGFR基因的过表达，从而为进一步研究EGFR基因在肿瘤发生中所起的作用做准备。
- 国内外研究概况
CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）-Cas(CRISPR-associated)系统是一个广泛存在于细菌和古细菌中的，由RNA介导的，可遗传的获得性免疫系统。这种免疫系统为宿主细胞提供了对外源DNA（如噬菌体，质粒）的免疫功能，一个典型的CRISPR/Cas基因座由一个编码Cas蛋白的操纵子以及一个重复-间隔序列组成。重复-间隔序列由多个相同的重复序列及穿插其间的间隔序列组成，间隔序列可以特异性地识别外源核酸。CRISPR系统可分为三种类型，即CRISPR/Cas系统类型Ⅰ，Ⅱ以及类型Ⅲ，每个类型又可以根据所含Cas蛋白基因的不同再分为几个亚类。
类型Ⅰ以及类型Ⅲ CRISPR/Cas 系统在发挥作用时只需crRNA以及Cas蛋白的参与。与前两者不同，CRISPR/Cas系统类型Ⅱ在发挥作用时除了需要crRNA以及Cas蛋白之外，还需要tracrRNA的参与。Cas1及Cas2蛋白存在于所有的CRISPR-Cas系统中，它们与间隔序列的获得过程有关。Cas9蛋白在CRISPR-Cas系统类型Ⅱ中具有核酸内切酶的功能。crRNA经转录加工成熟后，与tracrRNA共同引导Cas9蛋白对靶序列进行切割。
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