PH敏感紫杉醇纳米粒文献综述

研究内容

高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL) 是一种广义的内源性脂质体, 其独特的亲水 - 疏水结构、较大的脂质核心、较长的半衰期、良好的生物相容与生物可降解性以及不被网状内皮系统识别和清除的特性,使其用作药物载体的研究备受关注。研究表明，利用高密度脂蛋白作为纳米载体，搭载抗癌药物，能够实现较好的肿瘤靶向作用，提高化疗疗效，明显降低毒副作用。肿瘤细胞因增值速度过快，乳酸累积，从而导致肿瘤组织形成特定的弱酸性环境。因而将高密度脂蛋白制成PH敏感型纳米载体，在肿瘤特定的低PH环境下释放抗癌药物，可以更好的实现抗肿瘤靶向作用。相关报道较为少见。

本课题拟设计出高密度脂蛋白类PH敏感载体，搭载传统抗癌药物紫杉醇，提高紫杉醇化疗疗效，降低其毒副反应。

研究手段

一、载脂蛋白A-Ⅰ载紫杉醇纳米粒（ApoA-Ⅰ-PTX-NPs）的制备

1、高密度脂蛋白的分离提纯:使用硫酸右旋糖酐沉淀高密度脂蛋白，之后进行超速离心，分离高密度脂蛋白，得到的高密度脂蛋白经脱脂后得到载高密度脂蛋白。

2、载脂蛋白A-Ⅰ的分离提纯:使用凝胶过滤柱层析分离载脂蛋白A-Ⅰ。

3、载脂蛋白A-Ⅰ载紫杉醇纳米粒的制备:使用薄膜水化法制备载脂蛋白A-Ⅰ载紫杉醇纳米粒。

二、ApoA-Ⅰ-PTX-NPs的表征

1、用于紫杉醇含量测定的HPLC法的建立

2、激光粒度仪测定其粒度分布

3、zeta;电位的测定

4、粒子形态的测定

5、包封率与载药量的测定

三、体外实验

1、不同PH条件下的释药特性

2、体外细胞毒性试验

3、体外细胞摄取实验

四、体内实验

1、动物学实验考察药动学参数，参比市售制剂，考察生物利用度

2、荧光活体成像考察体内分布

3、动物体内抗肿瘤实验

文献综述

紫杉醇最初是由美国化学家Wani等[1]于1971年从红豆杉属植物短叶红豆杉(Taxus brevifolia)的树皮中分离提取出的一种复杂的次生代谢产物，是一种微管的特异性稳定剂，可促进微管的装配和保持微管稳定，紫杉醇主要适用于卵巢癌、乳腺癌和非小细胞肺癌，而且对食管癌、头颈癌等其他一些恶性肿瘤也具有一定疗效，是目前临床化药疗法的一线用药[2]。然而，紫杉醇的水溶性极小，从而造成给药困难，极大地限制了这种天然活性产物应用于肿瘤治疗。

临床应用的主要为紫杉醇注射液，是通过将紫杉醇溶于聚氧乙烯蓖麻油(Cremophore EL)与无水乙醇(1:1)的混合溶剂中制成的。但是大量研究表明，该注射液中的聚氧乙烯蓖麻油易引起胃肠道反应、过敏反应、低血压、肾毒性、心脏毒性和骨髓抑制等多种毒性反应，极大地限制了临床应用[3，4]。目前，一种全新的注射用紫杉醇白蛋白纳米混悬液已于2005年由FDA批准上市[5]，商品名为Abraxane。Abraxane不含聚氧乙烯蓖麻油，因此不需要在给药前进行抗过敏预处理，且毒性较低[6]。然而，近期有研究表明，Abraxane在乳腺癌治疗的Ⅲ期临床实验中，体现出了较非Abraxane治疗组更高的感觉神经病变率[7]；且应用Abraxane的整体价格较传统的紫杉醇注射液更为昂贵[8]。此外，注射用紫杉醇脂质体(L-PTX)于2003年由SFDA批准在国内上市[9]，而紫杉醇脂质体相关载药体系在国外目前还主要处于临床试验和临床前研究阶段[10，11]。但紫杉醇脂质体存在包封率低，紫杉醇易泄露等问题[12]。随着近年来的研究又发现，脂质体较大的粒子半径及其脂质双分子层中大量的胆固醇能够激活体内的补体系统，引起补体系统介导的假变态反应CARPA[13]，这种反应在临床上多表现为心肺功能的损伤，因此限制了紫杉醇脂质体在临床上的应用[14，15]

肿瘤部位由于其独特生理结构及代谢特征，使其生理微环境不同于正常组织， 具有高压、 高温、 胞外胞内氧化还原性差异、 特定的酶代谢、 pH值低等一系列特征［16 ］ 。根据以上特性设计的载体称为刺激- 响应 载体。临床研究发现， 只有pH 值(pH6. 0 ～7. 0)较低这一现象在绝大多数肿瘤患者中具有共性表现， 这主要是由于肿瘤的快速增殖导致与供氧不足， 葡萄糖过度酵解， 淋巴循环不畅使酸性物质累积所导致 ［17 ］ 。此外， 药物载体与细胞膜结合并通过内吞作用进入胞质后， 胞内形成包含载体等大分子的囊泡状结构 内含体， 接下来输送至溶酶体把载体等大分子消化降解， 而内含体和溶酶体内 pH 值也较低(内含体pH5. 5 ～6. 5， 溶酶体 pH4. 5 ～5. 0) ［18 ］ 。因此利用肿瘤微环境 pH 值较低以及肿瘤细胞内含体和溶酶体的酸性环境触发载体释药和逃逸是目前肿瘤靶向载体设计的研究方向之一。

纳米粒作为抗肿瘤药物的治疗，可以改变药物在体内的分布和药动学特性，使药物在体内的滞留时间延长;另一方面，肿瘤部位的细胞通透性增大，有利于载药纳米粒的透入，纳米粒的应用可以提高药物对肿瘤部位的靶向性，提高疗效，降低毒副作用。另外纳米粒跨细胞膜的机制与游离药物不同，主要以内吞的方式进入细胞，不受细胞膜上相应泵的作用。已有实验证实，抗肿瘤药物与纳米粒结合后可以克服肿瘤组织的多药耐药性(MDR)问题。制备纳米粒的方法主要有乳化聚合法、天然高分子聚合法、液中干燥法、自乳化-溶剂扩散法、溶剂蒸发法。

pH-敏感型的聚合物构成的纳米载体已经应用于抗癌药物的给药系统。 pH-敏感型纳米载体的物理性质例如膨胀或退胀、粒子的分散和聚集都对环境条件的变化产生响应。这些物理性质的改变也会使纳米载体与细胞之间的相互作用发生改变，从而导致药物在肿瘤部位不同速度的释放。pH-敏感型的多聚beta;-氨基酯[poly(beta;-amino ester)，PbAE）构成了向专一部位传递药物和基因的给药系统的生物可降解的阳离子聚合物。一旦在肿瘤的酸性环境下（pH lt;gt;出和释放内容物。制备紫杉醇的PbAE纳米粒，研究发现其在肿瘤部位的药物浓度相对于紫杉醇的聚己内酰胺（polycaprolactam, PCL，非pH-敏感型聚合物）纳米粒明显增高 [19] 。Fan [20]等人制备了包裹喜树碱的N-异丙基丙烯酰胺聚合物[poly(N-isopropylacrylamide), NIPAAm]/壳聚糖纳米粒，该纳米粒具有pH敏感性，将药物靶向释放于肿瘤组织。当NIPAAm与壳聚糖投料的质量比为4:1时，载药纳米粒对pH最敏感。因为核内体的高降解活性，在细胞内将药物或基因传递到巨噬细胞是一挑战。炎症反应和异物反应都是由巨噬细胞介导的。另外，巨噬细胞也是抗原传递细胞，在T和B淋巴细胞的生长中发挥重要作用。因此，巨噬细胞是治疗炎症和免疫应答的很重要的靶部位。利用pH-敏感纳米粒提高基因向巨噬细胞内传递，已越来越受关注，例如，反义寡核苷酸类、抗原蛋白和肽类。

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