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天然来源的硫酸化糖类大多来自于海洋生物,如岩藻聚糖硫酸酯、卡拉胶(硫酸半乳聚糖)、海胆多糖、海藻多糖、海洋硫酸鼠李糖等,具有独特的结构和聚阴离子的性质,在抗炎、抗凝血,抗氧化、抗病毒、增强免疫,以及肿瘤辅助治疗等方面发挥巨大作用。
硫酸转移酶是酶法合成硫酸寡糖的重要工具酶,然而大多数硫酸转移酶都存在于真核生物细胞内,原核表达存在表达量低、表达产物为包涵体、表达产物没有活性等问题,因此硫酸转移酶的原核表达是生产硫酸寡糖过程中非常重要的步骤。
本研究选择2-O-硫酸转移酶(2-OST)作为研究对象,旨在寻找到最适合进行原核表达的2-OST基因,并选择合适的原核可溶表达策略构建质粒使其表达,同时采用合适的方式对2-OST进行纯化,探究2-OST的酶学性质表征。
通过增加溶解度可以增加原核表达。
目前,增加溶解度的最成功策略可能是使用融合蛋白构建体。
亲和标签的使用已被证明可以提高蛋白质产量,防止蛋白质水解,增加蛋白质的溶解度[1,2]。
例如,在最近的研究中,Thu等人[3]描述了一种在BL21(DE3)大肠杆菌细胞质中使用MBP标签融合构建体以可溶性形式表达人干扰素α-2b (IFNα-2b)的有效方法。
IFNα-2b是一种糖蛋白,与2-OST同样具有倾向于在原核细胞中表达时形成包涵体的问题。
结果显示,较低的表达温度会增加IFNα-2b在大肠杆菌中的溶解度和表达水平;使用固定金属亲和色谱和阴离子交换色谱从MBP标签的融合物中纯化了IFNα-2b,从500 ml细胞培养物中获得了7.2 mg含低水平内毒素的纯IFNα-2b;使用萤火虫荧光素酶测定法证明了纯化的IFNα-2b的生物活性。
得出使用MBP标签融合蛋白是生产纯IFNα-2b的一种有效方法。
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