转基因烟草毛状根中倍半萜类物质的检测方法研究
摘要：世界卫生组织报告癌症已成为人类第一大杀手。榄香烯是一种安全可靠的新型广谱抗瘤药物,改善患者症状,提高生存质量[1]。毛状根培养技术因其巨大的潜力，逐渐成为次生代谢物生产应用中的一条可靠和有效的途径[2]。该技术的产生解决了榄香烯原料药莪术品种退化，繁种速度慢，单产水平低的问题。但由于转基因植物外源基因拷贝数与插入位点具有不确定性，建立高效精确的检测方法对于高产毛状根的筛选和质量控制具有重要意义。
关键词：倍半萜； 榄香烯；毛状根；检测方法
一、文献综述
倍半萜（sesquiterpenes）是指分子中含15个碳原子的天然萜类化合物，含有三个异戊二烯单元，在自然界中分布广泛[3]。中药道地药材中倍半萜类物质多具有重要的生物功能和生理活性。七十年代对生理活性的研究,主要是对其解痉、锁咳、祛痰、驱虫,以及对中枢、心脏等方面作用的研究，如吉马酮、雪松醇、蜂斗菜素等均有较强解痉作用;愈创木醇等的镇咳、祛痰作用;山道年祛蛔虫,异土木香内酯、大花旋复花素、斯提作菊素对阿米巴灭杀的作用;天名精内酯、天名精酮、缬草烯酸等对中枢神经系统的抑制;土木香内酯、牛蒿素等对心脏的抑制作用。近年来对倍半萜生理活性有更深的研究进展：如莪术中的榄香烯具有抗肿瘤活性，黄花蒿中的青蒿素具有抗疟活性，堆心菊中的堆心菊素具有抗高血脂、抑制肝细胞损害活性，另有抗菌消炎、抗病毒、免疫调节、昆虫拒食剂和植物生长抑制等活性[4]。
榄香烯是国家二类非细胞毒性的广谱抗肿瘤新药，是从姜科植物温莪术挥发油中提取的由碳、氢两种元素的倍半萜烯类化合物，其主要成分为beta;-榄香烯[5]。与具有细胞毒性的化疗药物相比，榄香烯毒副作用小，没有明显的心、肝、肾功能损害，不发生骨髓抑制[6]。且榄香烯还具有抗瘤谱广泛,疗效确切等突出特点。临床上用于恶性胸腹腔积液、肺癌、胃癌、食管癌、肝癌、脑转移性肿瘤、骨转移性肿瘤、膀恍癌、结肠癌及直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等治疗 [7]。
毛状根培养是20 世纪80 年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，通过将发根农杆菌中Ri 质粒含有的T-DNA 整合到植物细胞的DNA 上，诱导植物细胞产生毛状根，较传统农业生产大大缩短生产周期,不受气候条件影响,可人为控制生产条件,省时省地。毛状根属于激素自养性，生长速度快，分化程度高,产生次生物质能力强而稳定，繁殖潜能强,可以制成人工种子长期保存并可通过基因工程方法,增加次生物质含量，具有生物转化功能,可产生许多新的化合物，还可将部分次生代谢产物分泌释放到培养液中,有利于次生代谢产物的回收提取和工业化生产[8]。但此方法仍具有缺陷，即由于外源基因通过载体与作物基因组进行重组,整合的方式是随机的，因而转基因植物外源基因拷贝数与插入位点具有不确定性，生产具有优良性状且安全性高的转基因作物具有一定难度[9]。瑕不掩瑜，农杆菌诱导生成毛状根具有的遗传稳定性高、快速、无激素等优点，仍被认为是一种很有前途的药用植物次生活性成分的生产系统[10]。
中药指纹图谱全称为中药化学指纹图谱,是指运用现代分析技术得到能够标示某种中药材或中成药等的色谱或光谱的图谱,最终用于评价中药质量的科学方法。中药指纹图谱是控制中药材、半成品、最终产品的真实性、一致性和稳定性的可行而有效的手段,它的建立为中药质量控制提供了新的标准,同时也为我国的中药现代化建设奠定了良好基础[11]。中药指纹图谱的应用在许多现代色谱、光谱分析技术在中药指纹图谱测定中都有应用 ,如TLC、HPLC、NMR、MS、UV、IR、X-射线衍射 ,以及先进的光色谱联用技术最近也已被采用 ,另外如高速逆流色谱 (HSCCC) ,高效毛细管电泳色谱 (HPCE)等较新兴的分离技术也在指纹图谱测定方面有了一定的应用。今后中药指纹图谱的研究趋势必将向多学科的相互渗透 ,从单指标向多指标的综合的方向发展[12]。
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