姓名

刘孟昕

学号

2020170817

专业

药学

（理科基地）

指导教师

肖易倍

课题名称

SARS-CoV-2中PLP蛋白酶的抑制剂筛选及结构研究

课题性质

radic; 基础研究 应用课题 设计型 调研综述 理论研究

一、课题背景

2019年12月，中国湖北省武汉市发现多起病毒性肺炎病例，患者发热、干咳，严重者呼吸困难、血氧低，进而导致急性呼吸窘迫综合征、脓毒症、休克、代谢性酸中毒、凝血功能障碍以及多器官功能衰竭。通过对肺炎患者的样本进行全基因组序列检测及病原核酸检测，发现了一种新型冠状病毒。它是目前发现的能够感染人类的第七种冠状病毒[1]。经商讨，国际病毒分类委员会（The International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV）将其正式命名为SARS-CoV-2[2]。

SARS-CoV-2与之前引起全球关注的SARS-CoV、MERS-CoV同属于冠状病毒科，主要结构为核衣壳和包膜，单独可以在体外存活24小时，可在低温条件下长期存活，对75%乙醇、紫外线、乙醚、含氯消毒液等以及高温敏感[3]。SARS-CoV-2与血管紧张素转化酶2(ACE2)相互作用，从而进入宿主细胞。由于ACE2在Ⅱ型口腔、鼻腔、眼结膜、肺细胞、食道鳞状上皮细胞、复层上皮细胞以及回肠、结肠中表达，因此病毒能够通过飞沫、食物等途径进入呼吸道、胃肠道进行传播[4]。

SARS-CoV-2的基因为约29kb的正义单链RNA，编码结构蛋白、非结构蛋白和辅助蛋白，其中结构蛋白包括刺突蛋白（S），包膜蛋白（E），膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N），非结构蛋白主要包括3-胰凝乳蛋白酶样蛋白酶(3C-like protease,3CLpro)、木瓜蛋白酶样蛋白酶(Papain-like protease,PLpro)、解旋酶(helicase)和RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)。基因组的前2/3部分翻译为两个大的复制酶多聚蛋白pp1a和pp1ab，在PLpro和3CLpro的作用下，被切割成16个非结构蛋白（nsp1-16）。这些非结构蛋白参与调节病毒基因组RNA的复制和亚基因组RNA的转录, 或作为转录/复制复合体参与基因组的复制转录, 并参与病毒感染宿主等过程, 是冠状病毒重要的功能蛋白[5-8]。同时，PLpro是一种去泛素化酶，不利于先天免疫应答[9]。此外，PLpro还是干扰素（IFN）抑制蛋白。正常情况下，病毒感染后，宿主将立即激活免疫机制以产生IFN，使人体处于抗病毒状态，从而限制病毒的复制和传播。而PLpro对IFN-beta;途径和干扰素调节因子3（interferon regulatory factor 3,IRF-3）途径均具有显着的抑制作用[10, 11]。因此，将SARS-CoV-2基因组所编码的 PLpro作为开发药物的有效靶点，进行抑制剂的制备，对于COVID⁃19的治疗具有重要意义。

尽管SARS-CoV-2和SARS-CoV的PLpro序列仅显示83％的相似性，但PLpro活性位点的高级结构没有变化[13]。 目前已有研究确定在临床上广泛用于治疗儿童急性淋巴细胞白血病和髓样白血病的6-巯基嘌呤（6-MP，IC50 = 21.6mu;M）和6-硫鸟嘌呤（6-TG，IC50 = 5mu;M）可以竞争性、选择性和可逆的与PLpro结合并抑制其作用，Ki值为10至20mu;M[14]。研究发现6-MP或6-TG的硫羰基部分是具有这些抑制作用的活性药效团，机制可能为硫羰基的硫醇部分在酶的活性位点与Cys1651形成氢键，以防止酰化作用并抑制酶的活性。以6-MP或6-TG为先导化合物，进一步优化，可以开发出更好的抗病毒药物。

许多研究小组已经通过虚拟筛选确定了PLpro抑制剂。例如，Mukesh Kumar等人以SARS-CoV PLpro晶体结构（PDB代码：3E9S）作为模板来虚拟筛选潜在的SARS-CoV-2 PLpro抑制剂，发现FDA批准的16种药物（包括Biltricide , Cinacalcet , Procainamide , Terbinafine , Pethidine , Labetalol , Tetrahydrozoline , Ticlopidine , Ethoheptazine , Formoterol , Amitriptyline , Naphazoline , Levamisole , Benzylpenicillin , CQ , Chlorothiazide）对SARS-CoV-2 PLpro表现出良好的亲和力，指出这些药物可用作进一步研究的候选药物[15]。此外，双硫仑(Disulfiram)是一种潜在的PLpro抑制剂，可作用于SARS-CoV-2 PLpro的活性位点并与Cys112形成共价加合物[16]。

Wioletta Rut等人发现SARS-CoV-2 PLpro的S2口袋具有高度的底物特异性，只有甘氨酸可以被接受；而S3口袋具有广泛的底物特异性，不仅可以耐受带正电荷的残基，例如Phe，Dap，dab，Arg，Lys，Orn和hArg，而且还可以耐受疏水性氨基酸，例如hTyr ，Phe（F5），Cha，Met，Met（O），Met（O）2和D-hPhe；但S4口袋只能容纳疏水性残基[17]。

这些研究旨在确定靶向SARS-CoV-2 PLpro的肽类抗病毒化合物、阐明抑制剂特定的作用机理，为进一步研究SARS-CoV-2 PLpro提供了重要信息，有助于加快冠状病毒特效药的研发进程。

1. 要解决的问题

筛选出SARS-CoV-2 PLpro的高抑制活性化合物；将抑制剂与蛋白共结晶并进行结构解析。

1. 可行性分析

本课题对SARS-CoV-2 PLpro进行重组载体构建及表达纯化，使用荧光法筛选出高抑制活性化合物，进而将抑制剂与蛋白共结晶并进行结构解析，有助于加快冠状病毒特效药的研发进程、阐明抑制剂特定的作用机理，并对药物创新设计有一定的指导意义，为应对相关流行性疾病提供帮助。

1. 研究方法和内容
2. 质粒构建：构建含有SARS-CoV-2 PLpro基因和His标签或含有SARS-CoV-2 PLpro C111S点突变基因和His标签的质粒，以表达SARS-CoV-2 PLpro。
3. 蛋白纯化：将构建的质粒转化到相应的细胞中；培养细胞，并诱导其表达SARS-CoV-2 PLpro或其突变体；裂菌，收集细胞表达的蛋白；通过镍柱、分子筛纯化所得蛋白，SDS-PAGE辅助证明；将蛋白浓缩后，液氮速冻保存。
4. 荧光法：将不同浓度的SARS-CoV-2 PLpro或其突变体与相应荧光底物结合，通过酶标仪检测荧光强度，使用GraphPad Prism软件通过Michaelise-Menten方程V = V_max x [S]/（K_m [S]）拟合该图，以得出动力学参数V_max 和 K_m，根据公式k_cat =V_max /[E]，计算 k_cat，并确定合适的抑制剂筛选实验所用的蛋白浓度；将SARS-CoV-2 PLpro与不同的化合物孵育，再与荧光底物结合，通过酶标仪检测荧光强度，确定PLpro催化底物水解的内在（V_0i）和表观（V_appi，K_appi）催化参数的值，由 V_appi 对固定底物浓度（[S]）下抑制剂浓度（[I]）的依赖性根据方程 V_appi = V_apptimes;[I]/（K_appi [I]）得出抑制剂与PLpro结合的表观抑制常数（K_appi），并根据方程 K_appi = K_itimes;（1 [S] /K_m）计算得出抑制剂与PLpro结合的内在抑制常数（K_i）的值，通过 GraphPad Prism软件计算化合物的IC₅₀值。
5. 晶体筛选及优化：将一定浓度的SARS-CoV-2 PLpro或SARS-CoV-2 PLpro C111S与抑制剂孵育一段时间以形成复合物，放入不同的池液中进行结晶，一段时间后显微镜观察以确定合适的结晶池液条件。
6. 工作计划

2月28日—3月20日：完成文献查阅、开题报告等前期工作。

3月21日—5月10日：完成质粒构建、细胞转化、细胞培养、蛋白纯化、酶活实验、晶体筛选等工作。

5月11日—5月20日：完成毕业论文的撰写工作。

5月21日—6月04日：完成毕业论文的评阅、答辩与修改工作。

6月05日后：完成毕业论文的校对、归档等工作。

[参考文献]

[1] Zhu, N., et al., A Novel Coronavirus from Patients with Pneumonia in China, 2019. N Engl J Med, 2020. 382(8): p. 727-733.

[2] Coronaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of, V., The species Severe acute respiratory syndrome-related coronavirus: classifying 2019-nCoV and naming it SARS-CoV-2. Nat Microbiol, 2020. 5(4): p. 536-544.

[3] 新型肺炎诊疗方案试行第三版：冠状病毒对热敏感. 2020.

[4] Zhou, P., et al., Discovery of a novel coronavirus associated with the recent pneumonia outbreak in humans and its potential bat origin. 2020.

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[6] Gao, X., et al., Crystal structure of SARS-CoV-2 papain-like protease. Acta Pharm Sin B, 2020.

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[14] C.Y. Chou, C.H. Chien, Y.S. Han, M.T. Prebanda, H.P. Hsieh, B. Turk, G.G. Chang, X. Chen, Thiopurine analogues inhibit papain-like protease of severe acute respiratory syndrome coronavirus, Biochem. Pharmacol. 75 (8) (2008):1601–1609.

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[17] W. Rut, Z. Lv, M. Zmudzinski, S. Patchett, D. Nayak, S.J. Snipas, F. El Oualid, T. T. Huang, M. Bekes, M. Drag, S.K. Olsen, Activity profiling and structures of inhibitor-bound SARS-CoV-2-PLpro protease provides a framework for antiCOVID-19 drug design, bioRxiv (2020), 2020.04.29.068890.

学生签名： 2021年03月18日

指导教师意见：

指导教师签名： 年03月19日

指导教师所在教研(研究)室审查意见：

负责人签名： 年03月20日