开题报告内容：（包括拟研究或解决的问题、采用的研究手段及文献综述，不少于2000字）
- 课题背景及研究思路
O2对于所有微生物的生存至关重要, 是维持细胞内能量平衡的有氧代谢必不可少的物质。缺氧, 是指O2水平低于正常的状态, 可出现于各种生理情况( 胚胎发育、适应高海拔、伤口的愈合) 与病理情况下( 缺血性疾病和癌症) 。缺氧是一系列神经疾病( 包括卒中、脊髓损伤和外伤性脑损伤) 的中心因素, 为了适应缺氧, 微生物出现一系列系统性和局部性的改变以维持O2的平衡, 减低缺氧的影响。系统性的改变是增加体内血流量以增加氧的运输; 局部性改变主要是血管再生; 在细胞水平, 最显著的适应缺氧的反应是减少氧化磷酸化, 增加糖酵解, 以增加ATP 的产量; 在分子水平, 主要的调节细胞对缺氧反应的调控者是缺氧诱导因子( HIF-1)。细胞内HIF的含量由PHD（脯氨酰羟化酶）来决定。1
低氧诱导因子(hypoxia inducible factor，HIF)是上世纪九十年代初由Semenza 等人发现的一类氧敏感性异二聚体蛋白，对机体在低氧条件下发生的一系列生理学改变起到关键性调控作用。研究发现，在组织贫(缺)血和炎症性疾病中，HIF 蛋白的稳定表达，对缓解病情具有重要作用2-3。脯氨酸羟化酶(prolyl hydroxylase domain，PHD)作为HIF 降解反应的限速酶，可对HIF 进行羟基化，促进HIF 蛋白的降解，从而影响HIF 所介导的相关疾病的治疗4。因此，靶向PHD 的小分子抑制剂研究已成为当前治疗贫血、缺血及炎症等疾病的重要策略之一。
HIFs是由三种氧敏感性alpha;亚基——HIF-1alpha;，2alpha;和3alpha;组成的转录因子家族以及一种基本表达的beta;亚基HIF-1beta;，亦被称作芳香烃受体核转运蛋白（ARNT）。一旦HIF-alpha;:ARNT复合物形成，则入核并且激活包含缺氧反应元件（HREs）的基因的转录5-6。造血细胞包括造血干细胞（HSCs）表达HIF-1alpha; mRNA，HIF-1alpha; mRNA在所有细胞中都表达。在含氧量正常的情况下或者当氧气浓度超过2%时，HIF-1alpha;蛋白在五分钟内被蛋白酶体降解7，防止转录因子的形成以及入核。常氧条件下，在Fe2 和alpha;-酮酸存在的条件下，氧依赖降解域（ODD）的某些保守的脯氨酸残基（HIF-1alpha;中的Pro-402、Pro-564，HIF-2alpha;中的Pro-531和HIF-3alpha;中的Pro-490）被脯氨酸羟化酶羟基化，随后，羟基化的HIF-alpha;与肿瘤抑制蛋白（pVHL）的beta;结构域结合，再被pVHL-E3连接酶复合物泛素化，导致被标记的HIF-alpha;被26S蛋白酶体降解。而低氧条件下，氧依赖的HIF-alpha;的蛋白水解酶降解作用不能进行。8
PHD 是一类非血红素铁依赖性加双氧酶，目前已发现4 种亚型，即PHD1、PHD2、PHD3 和PHD4。通过序列对比和模型研究发现，PHD1~3 3种亚型在C-末端结构域有极高的序列同源性，但其在细胞内的分布及功能却各有不同，其中，PHD2 是低氧信号通路中最重要的脯氨酸羟化酶亚型；而对PHD4 结构与功能的研究较少9。在氧气、铁以及alpha;-酮戊二酸(alpha;-ketoglutaric acid，2-OG)(化合物1)的存在下，PHD 可实现多种底物的羟基化，包括HIF1alpha;~3alpha;、NF-kappa;B10、激活转录因子411等。以HIF-1alpha; 为例，常氧条件下，PHD可以识别HIF-1alpha; ODD 区的脯氨酸残基Pro402 和N-TAD 区的Pro564，使之发生羟基化，进而经希佩尔林道蛋白介导而进行泛素化降解。在缺氧条件或PHD 抑制剂存在时，PHD 羟基化活性下降，阻碍了HIF-1alpha; 的降解，使HIF-1alpha; 稳定表达并积累，从而激活下游靶基因，改善贫血、局部组织缺血以及组织损伤相关疾病12。因此PHD 抑制剂的研发已经成为相关疾病治疗的重要策略之一13。
PHDs能够对HIF-alpha;进行调控，而PHD2和PHD3则受到HIFs的反馈调节导致上调。研究发现，PHD2基因中含有能被HIF-1alpha;识别的低氧应答元件（HRE），PHD3基因中则含有能被HIF-2alpha;识别的HRE，在低氧条件下，由于HIF-alpha;的累积，PHD2和PHD3上调。
PHDs对HIF-alpha;的含量的调控的生理作用已通过不同方法进行评估，PHD2对HIF-alpha;水平的调控起着决定作用，而PHD1和PHD3作用则较为微弱。同时通过观察家族性红血球增多症人群，发现PHD2突变会导致造血功能下降，从而证明PHD2对造血功能起支配作用。而PHD2基因敲除小鼠由于在造血功能和血管形生成功能上的缺陷，在胚胎发育过程中即死亡，相反，PHD1和PHD3基因敲除小鼠表现出较为轻微的症状的实验，进一步证实PHD2对HIF的中心作用。
人类遗传学的研究表明，PHD酶系在调节红细胞生成上起关键作用，这说明对这个系统进行药物介入可能会在生理学和病理学上产生意义深远的影响，同时巩固了一个重要的、全新的可进行药物设计的治疗性的蛋白靶标。由于可以促进HIFs的表达，PHDs被认为是一个针对贫血和缺血的治疗靶点。PHD抑制剂被设计用来激活HIF相关通路从而促进HIF相关基因的表达。14
由于PHDs需要铁离子和alpha;-酮酸来催化HIF脯氨酸残基的羟化，任何能够竞争内源性二价铁离子和alpha;-酮酸的化合物都可以作为PHD抑制剂。15去铁素（DFO）、氯化钴（CoCl2），铁离子螯合剂和竞争性铁离子抑制剂都能通过竞争内源性二价铁离子来抑制PHD活性。其他铁离子螯合剂如环吡酮胺，及竞争性铁离子抑制剂如Cu2 、Zn2 、Mn2 ，也是PHD抑制剂。然而，它们通过作用于内源性二价铁离子而抑制PHD的同时，也将影响其他铁依赖性的酶。酮酸类似物，如L-含羞草酸（L-mim）、二甲基草酰甘氨酸（DMOG）、3,4-二羟基苯甲酸甲酯（3,4-DHB），则能通过竞争内源性alpha;-酮酸来抑制PHD。许多细胞和动物实验揭示酮酸类似物能对HIFs的稳定产生有利的作用。16
铁离子螯合剂通过抑制PHD 活性，可以改善炎症性胃肠道疾病的症状，如去铁酮和Mimosine等。到目前为止，Fibro公司研发的FG-4592(Ⅲ)，Akebia Therapeutics 公司以羟基吡啶酮为母核，研发了一类吡啶-2-酮类PHD 抑制剂 17，AKB-6548(Ⅲ)， GSK 公司研发的GSK-1278863(Ⅱ)，Bayer 公司研发的BAY-85-3934(Ⅱ)，均作为PHD 抑制剂进入临床研究18。
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