Nrf2 激活剂的发现以及生物活性评价文献综述

 2022-12-05 18:17:33

1. 文献综述

人体经常接触到各种内源性和外源性氧化物质以及亲电子化学物质,一些活性氧(ROS)和活性氮(RNS)在控制细胞氧化还原稳态方面起重要作用,持续的氧化应激状态可能会破坏细胞的正常结构,包括脂质、蛋白质、核酸等大分子物质。这种氧化损伤会导致慢性炎症的发生,还可能进一步转化成肿瘤、心血管疾病、神经退行性疾病、炎症疾病以及细胞衰老等,对人的身体健康造成危害。

而在正常的细胞中,存在一系列细胞防御机制对抗这些毒性物质给细胞造成的损伤,来维持细胞的正常功能。其中,抗氧化防御系统是主要的保护机制,细胞通过使用抗氧化剂来中和氧化物质和亲电试剂的破坏性影响。抗氧化剂可以分为直接抗氧化剂、间接抗氧化剂以及双功能抗氧化剂。直接抗氧化剂具有氧化还原活性并且在发挥作用的过程中很快被消耗,需要再生以提供进一步的保护,而间接抗氧化剂通过上调各种细胞保护机制来表现抗氧化作用,这些细胞保护蛋白被称为终极抗氧化剂,因为它们有较长的半衰期,在抗氧化过程中也不被消耗,还可以催化多种解毒反应,并且参与直接抗氧化剂的再生。

Keap1-Nrf2-ARE信号通路是对抗氧化应激和异生物质损伤最重要的一种细胞防御机制,以此通路为靶标设计Nrf2激活剂用于氧化应激相关疾病的预防和治疗具有重要意义。在细胞中主要有三种成分参与调节抗氧化反应,包括转录因子E2相关因子2(Nrf2),Kelch样相关蛋白(Keap1)蛋白和抗氧化反应元件ARE,三者组成的信号通路不仅能在转录水平上调细胞保护蛋白的含量,而且还能维持细胞氧化还原平衡和代谢。简而言之,Keap1-Nrf2-ARE信号通路可以诱导对抗氧化应激的适应性反应,否则可能会导致一些炎症疾病。Nrf2是外源性有毒物质和氧化应激的感受器,通过与抗氧化作用元件ARE结合直接激活细胞保护基因的转录,调节编码抗氧化蛋白。而Keap1蛋白以二聚体形式与Nrf2结合,阻止其进入细胞核,通过蛋白酶体途径促进其泛素化和降解,对Nrf2进行负调控。在机体基础条件下,Keap1和Nrf2在细胞质中结合并且被蛋白酶不断降解,Nrf2处于活性抑制的状态。当机体受到亲电试剂或者活性氧的进攻时,Keap1的半胱氨酸巯基被氧化或烷基化,Nrf2与Keap1解偶联,不再被降解而趋于稳定。此时,新合成的Nrf2积聚并转移入核,在核内与Maf蛋白形成异二聚体结合到ARE序列上,参与下游二相代谢酶的调控,进而启动ARE调控的基因的转录,发挥化学预防作用。

2. 研究问题

以Keap1-Nrf2-ARE信号通路为靶向目标来探索预防和治疗药物是一个新的策略。一些Nrf2-ARE诱导剂已经投入临床试验作为化学预防制剂来治疗涉炎症相关的肿瘤。

几乎所有目前已知的Nrf2激活剂都是Keap1-Nrf2相互作用的间接抑制剂,研究认为它们通过氧化或烷基化与Keap1的巯基形成共价结合物来产生作用,从而抑制Nrf2的降解。大多数已知的Nrf2激动剂都具有亲电性,然而并非所有的亲电试剂都可以调节其活性。近年来,有很多Nrf2激活剂被报道出来,如cuicumin,CAPE(caffeic acid phenethyl ester),AI-1, genistein、chalcone,SFN(sulforaphane)等,这些化合物在体内外都具有良好的化学预防作用。其中,迈克尔受体与 Keap1半胱氨酸巯基的进行可逆的共价结合,激活转录因子 Nrf2,使其具有抗氧化、抗炎、预防癌症的药理活性。然而,关于迈克尔受体的 Nrf2激活剂结构类型较少,活性普遍不高,使得 Nrf2激活剂的开发大大受限。已经存在的化学小分子结构简单,很容易出现脱靶效应。因此,在保留共价修饰方式的基础上,我们通过直接阻断Nrf2-Keap1的结合,提高分子骨架的靶标专一性,以增强小分子化合物的选择性,降低其非特异性。本课题的研究致力于寻找新型的Nrf2激活剂,通过进一步的结构优化,为开发作用于Nrf2-ARE信号通路的新型抗炎制剂提供新思路。

3. 研究手段

为了发现新型的Nrf2激活剂,各种筛选和评价方法应运而生。我们可以运用荧光素酶报告基因系统和 AOM-DSS 炎癌转化模型快速筛选目标化合物,然后再对化合物的生物活性进行评价。其中,最主要的荧光素酶报告基因系统采用在ARE下游转入一段荧光素酶报告基因的细胞株HepG2-ARE-C8的方法,只要化合物对细胞内的ARE有激活作用,那么它也将激活荧光素酶,荧光素酶催化荧光素底物氧化反应产生光能从而被机器捕捉到。 因此,利用此方法,我们可以快速地对化合物库进行筛选。借助于这些实验系统和检测手段,我们可以快速、准确、系统地筛选出Nrf2激活剂并研究其生物活性。下面简单介绍一下评价化合物活性的研究方法:

(1) MTT

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