研究背景
肾纤维化是各种原发或继发性肾脏病持续进展，导致正常肾脏组织结构被细胞外基质(ECM)所取代，伴有肾功能进行性不可逆损害的病理过程，是引起终末期肾衰竭的主要原因和病理基础之一。成纤维细胞是间质胶原主要分泌细胞，在肾脏纤维化生理病理过程中起着主导作用。在肾脏疾病时，肾间质内细胞分泌促纤维化因子，再以旁分泌的方式作用于成纤维细胞，使其分泌胶原Ⅰ、Ⅲ及纤维连接蛋白(FN)，导致肾脏纤维化最终导致肾功能衰竭[1][2]。肾衰宁胶囊由大黄、太子参、红花、丹参、冬虫夏草、牛黄、甘草等中药组成，不仅帮助毒素从肠道排出, 而丹参、红花、冬虫夏草等成分可活血化瘀、调节免疫，从而延缓肾功能衰竭的进展。此外，肾衰宁胶囊临床依从性较高，基本无副作用，患者普遍接受[3]。
本课题首先提取大鼠肾成纤维细胞，免疫荧光标记法鉴定。其次建立以TGF-beta;刺激大鼠肾原代成纤维细胞转分化模型，并研究肾衰宁胶囊对肾纤维化的改善作用。由于目前缺少治疗肾纤维化的药物，通过本课题的研究可以为研发更高疗效的治疗药物提供思路。
研究方法
使用组织贴壁法从乳大鼠体内提取肾原代成纤维细胞，使用免疫荧光法对原代细胞进行鉴定。TGF-beta;刺激大鼠肾原代成纤维细胞转分化，检测纤维化蛋白表达情况，并给予肾衰宁胶囊，研究其对肾纤维化的改善作用。
文献综述
- 原代成纤维细胞提取的概述及相关研究
近年来国内的提原代成纤维细胞大多是以提取皮肤、心脏、肺、肾或是肿瘤细胞为主。比如大鼠心脏成纤维细胞的原代培养，大多数都是从成年鼠或乳鼠心脏中提取再以酶消化法和差速贴壁法分别进行分离培养[4]。大鼠原代肺成纤维细胞的体外高效稳定的培养方法与大鼠心脏成纤维细胞大致相同，最常用胰蛋白酶消化和组织块混合培养法进行纯化与培养其后在采用显微镜下观察原代培养肺成纤维细胞的形态及其生长状况，免疫组化SABC法检测细胞中vimentin和alpha;-SMA蛋白表达。周期短、成本低的成年小鼠原代皮肤成纤维细胞分离培养方法，同样最常使用采用组织块贴壁法、酶消化法、酶消化组织块贴壁法进行原代皮肤成纤维细胞的培养,通过显微镜观察比较原代细胞的数量、形态、培养周期及纯度;通过免疫荧光、CCK-8、UVB辐照、流式细胞术进行生物学特性鉴别[5]。
国外在啮齿动物模型上的提原代成纤维细胞技术已经相对成熟，研究主要以提原代人成纤维细胞，更倾向于建立三维共培养模型，研究原代成纤维细胞在其他表型中形成的作用，主要来自人的口腔、真皮和癌细胞等，提原口腔成纤维细胞涉及到用HA处理人原代腭和牙龈成纤维细胞，观察其代谢、增殖和迁移能力。为了揭示HA影响细胞行为的机制，分别用qRT-PCR和免疫印迹法分析了创面愈合相关基因的表达和信号激酶的激活[6] 。另外也多应用于原发性癌症如肾癌中成纤维细胞培养物与细胞系的建立，包括机械分解，胶原酶消化和细胞筛选，以建立上皮细胞，而成纤维细胞从外植体生长[7]。最后应用免疫荧光和定量聚合酶链反应进行细胞特征分析。国内外对于大鼠肾成纤维原代细胞的提取方法均没有明确的说明。
- 大鼠肾纤维化细胞模型的建立
目前用于建立肾纤维化细胞模型的刺激剂有转化生长因子(TGF-beta;1)诱导肾间质纤维化。转化生长因子-beta;(TGF-beta;)、结缔组织生长因子(CTGF)被认为是强效的致纤维化因子，在肾间质纤维化中起重要作用。在多组织器官纤维化中起重要作用，肾成纤维细胞通常不分布在正常的肾脏组织中，当肾脏受到创伤或者处于炎症状态时，肾内转化生长因子(例如TGF-beta;1)等的分泌增加可能导致肾小管上皮细胞的极性丧失,细胞内紧密连接消失，细胞间粘连减少，导致肾小管上皮细胞向肾成纤维细胞的转化,转化后的肾成纤维细胞有成纤维细胞、间充质细胞和平滑肌细胞三大特性,可以表达多种标志蛋白，如alpha;-平滑肌肌动蛋白(alpha;-SMA)。转化后的成纤维细胞又可上调转化生长因子(如TGF-beta;1)的表达,进一步的加重肾脏病理改变。近年来通过上述体外诱导与培养正常大鼠肾成纤维细胞(NRK-49F)造模探讨药物对其所产生的的影响。如吉晶、何立群[8]采用TGF-beta;1刺激大鼠肾脏成纤胞增殖以及对FN，Col-I，Smad2/3蛋白及基因的影响，探讨大黄素对肾脏纤维化的保护作用机制。韩璐、胡涛[9]等采用大鼠肾间质成纤维细胞株NRK49f，验证GBE对大鼠肾间质成纤维细胞转化生长因子-beta; (TGF-beta;)、结缔组织生长因子(CTGF)及alpha;-平滑肌肌动蛋白 (alpha;-SMA) 过表达的抑制作用。2019年也出现应用重组Cthrl与TGF-beta;1处理的成纤维细胞，采用羟脯氨酸（Hyp）消化法测定经处理的成纤维细胞中与Cthrl与TGF-beta;1二者对胶原蛋白合成的影响[10]。
参考文献
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