一类新药吡咯并喹啉醌（PQQ）中有关物质的结构鉴定文献综述

 2023-01-05 18:49:54
  1. 研究或解决的问题

脱氢酶(Dehydrogenase) 的辅基有烟酞胺核苷酸(NAD 和NADP )、黄素核苷酸(FMN和FAD) 、辅酶A 、辅酶Q 等, 迄今为止, 对它们的结构、理化性质、生理功能已经进行了较深入的研究。在六十年代还发现了另一类脱氢酶, 它们并不依赖于烟酰胺核苷酸、黄素核苷酸等, 能氧化很多的一级醇, 并以甲基吩嗪硫酸甲酯为最初受氢体, 直到七十年代末才清楚它们含有一种新型的辅基—吡咯喹啉醌, 后来在氨氧化酶、硝基链烷氧化酶、腈水解酶等氧化还原酶中也发现有辅基吡咯喹啉醌, 并将这类以吡咯喹啉醌为辅基的酶统称为醌蛋白(Quinoproteins) , 目前发现主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中, 人们对它的结构、理化性质和生理功能做了一定研究, 认为吡咯喹啉醌不仅是醌蛋白的辅基, 而且作为一种生长因子, 促进微生物和植物的生长, 刺激植物花粉的萌发等[1]。

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）是一种不同于烟酰胺核苷酸（NAD 和NADP ）和黄素核苷酸（FAD 和FMN）的新有机辅酶，上世纪60 年代在研究非磷酸化细菌的葡萄糖代谢过程中被首次发现。1979 年，Durine 等分离了该辅酶，随后由Salisbury 等人确定其结构式为4,5- 二氢-4,5- 二氧-1- 氢-吡咯并（2, 3-f）喹啉-2,7,9- 三羧酸。从微生物到人体组织，PQQ在自然界的分布范围极广。动物和人类通过饮食途径获取PQQ 以满足机体需要。PQQ 具有极其独特的理化性质，其促生长、抗应激和在动植物发育繁殖方面的营养作用越来越受到重视[1]。PQQ主要采用生物合成方法，该方法被认为是最具有前景的工业化生产路线，而生物合成的具体步骤有待进一步探索[2]。本课题研究中，PQQ采用化学合成法。在合成过程中，由(NH4)2Ce(N03)4氧化M8到M9过程中得到两个有关物质，经柱层析后得到其纯品，命名为11和12。M8、M9、11和12的结构如Fig 1所示，本文所要解决的问题就是对这些相关物质采用合适的方法进行结构鉴定。

二、研究手段

本研究采用一维和二维核磁共振技术，结合质谱和红外测定结果，确证了PQQ纯学合成过程中两个未知物质的化学结构，分别为4-硝基-5-甲氧基-1氢吡咯[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸-2-乙酯-7，9-二甲酯和3-硝基-5-甲氧基-1氢吡咯[2，3-f]喹啉-2，7，9-三羧酸-2-乙酯-7，9-二甲酯，并对其信号进行了完整归属，为以后的研究及质控提供了理论依据。

NMR 是共振现象的一种, 是指原子核在运动中吸收外界能量产生的一种能量跃迁现象, 这种现象只能出现在相邻的两个能量之间。对氢原子而言, 在静磁场中处于两种基本能量状态, 指向磁场方向的原子核处于低能级, 逆向磁场方向的原子核处于高能级, 由磁场和温度来决定两种基本能量状态核子之间的动态平衡。将样品放入大磁场中, 加入与静磁场相交成一定角度的, 并发射与该样品原子核运动频率(原子核在静磁场中按正确的角度旋转频率, 也称拉莫尔频率) 相同的射频脉冲(RF 脉冲), 即RF 脉冲与拉莫尔频率相同时, 质子磁矩会吸收RF 脉冲的能量, 使磁矩从低能级跃迁到高能级, 称共振吸收。移去RF 脉冲后, 质子磁矩便从高能级回到低能级, 并将吸收的能量以电磁波的形式发射出来, 称为共振发射, 此吸收与发射的过程称为核磁共振。在化合物的结构鉴定中最常见也是最基本的核磁共振技术是一维核磁共振氢谱(1H-NMR)和一维核磁共振碳谱(13 C-NMR)。一维核磁共振氢谱提供的信息主要有化学位移, 偶合常数, 吸收峰的裂分方式和氢原子数目。通过化学位移值可以了解氢的偕碳是否有杂原子以及是sp3 还是sp2 碳原子;通过偶合常数的大小和吸收峰的裂分方式可以了解一个氢与它的邻碳上的氢之间的两面夹角,判断化合物的构型和构象以及是否存在偕偶。二维核磁共振(2D-NMR)是20 世纪70 年代提出, 80 年代初期发展起来的新技术。随着高频核磁共振仪的出现, 在80 年代末和90 年代初, 二维核磁共振得到了迅速发展, 现已成为有机化合物结构鉴定的常规分析方法, 也为天然产物的结构鉴定带来了一场革命[3]。

一维核磁共振(1H NMR 和13C NMR)和二维核磁共振(1H-1H COSY , NOESY , HSQC 和HMBC)是最基本的也是在化合物的结构鉴定中最常用的核磁共振技术。一个化合物的结构鉴定特别是一些结构比较复杂的天然产物的结构鉴定通常需要上述几种技术和高分辨质谱(HR-MS , HR-FAB-MS)的配合才能完成其平面结构的鉴定和立体化学的分析。

不同于以上的化学合成法制吡咯喹啉醌，所需过程繁琐昂贵，生物发酵法制PQQ相对而言较简单，前景广阔。横向比较，简单快速且不需要昂贵仪器的针对发酵液中PQQ 的检测方法另有其他三种，分别为活性电泳法（Native－PAGE 法）、光谱法和NBT－Gly 法。Native－PAGE有很高的分辨率， 既可对多组分蛋白进行分离纯化，同时又可以保留酶的活性，可对活性状态的酶进行检测；光谱法是以D326nm值与D400nm值的差值来检测PQQ 含量；NBT－Gly法利用了PQQ 的氧化还原特性。活性电泳法专一性好，具有很高的灵敏度，可靠但准确性较差；NBT-Gly法操作简便，可用于大量样品的检测，但重复性不佳；光谱法精密度较好，但样品中存在吸光物质时对检测结果影响较大。从相关文献中可看出，活性电泳法、光谱法和NBT－Gly 法可用于PQQ 的检测，活性电泳法适于培养上清等复杂样品的粗略定量，NBT－Gly 法适于大量样品的检测，光谱法适于纯度较高的PQQ 的定量[5]。

  1. 文献综述
  2. 张经纬, 赵永芳. 吡咯喹啉醌 (PQQ) 的研究进展[J]. 生物化学与生物物理进展, 1995, 22(1): 22-26.
  3. 张鹏, 孙慧玲, 孙静娴, 等. 吡咯喹啉醌 (PQQ) 营养作用研究进展[J]. 现代生物医学进展, 2014 (10): 1987-1990.
  4. 周怡雯，陈建华．新辅酶吡咯喹啉醌研究进展[J]．中国生化药物杂志，2008，3.29(4)：279-282．
  5. 张嫚丽, 史清文, 顾玉诚. 核磁共振技术及其在天然产物结构鉴定中的应用[J]. 河北医科大学学报, 2006, 1(1.13).
  6. 杨延新, 熊向华, 游松, 等. 3 种检测吡咯喹啉醌的方法比较[J]. 生物技术通讯, 2011, 22(4): 544-547.

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