一、课题背景
糖尿病（Diabetesmellitus, DM）是一种多病因的内分泌代谢综合征，其特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素分泌及/或作用缺陷所引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。国际糖尿病联盟（IDF）的最新统计数据显示目前全球约有 3.6 亿糖尿病患者，预计到2030 年，全球糖尿病患者人数将增加到5.52亿；而我国现有糖尿病患者约 9700 万，患病人数位全球之首，预计到 2030 年则会达到 1.29 亿[1]。糖尿病现已成为继心脑血管疾病、癌症之后的威胁人类健康的第三大疾病[2]。
目前，市场上常见的抗糖尿病药物包括磺脲类和非磺脲类的促胰岛素分泌剂，补充内源性胰岛分泌不足的各类胰岛素及其类似物，噻唑烷二酮或双胍类针对胰岛素抵抗的胰岛素增敏剂等[3] 。然而这些传统药物对胰腺beta;细胞功能衰减这一糖尿病病因缺乏靶向作用，并且还病存在一系列如体重增加、低血糖症、水肿等副作用[4]，加重了糖尿病并发症的发生。
新型的肠促胰素型糖尿病治疗药物胰高血糖素样多肽-1（GLP-1）因其副作用小，效用广泛等特性在糖尿病及其并发症治疗领域得到了广泛关注。GLP-1受体是G蛋白偶联受体（GPCR）B家族中胰高血糖素样受体亚家族中的一员，它最明显的特征是有相对较长的胞外N端序列，通过3对二硫键形成一个球状结构域，这个区域同7个跨膜区段间通过特定氨基酸残基之间的相互作用形成复杂的空间构象，在配体结合的过程中起关键作用[5]。GLP-1受体广泛分布于胰腺、大脑、肺、肾脏、胃以及心脏等组织，它是一种由远端回肠、直肠和结肠的L细胞分泌的多肽激素,受肠腔内营养物质如葡萄糖、脂肪等刺激释放[6]。在葡萄糖代谢的主要外周组织中（肝脏、骨骼肌、脂肪组织），也发现存在高亲和力的GLP-1结合位点。从人类的器官，如大脑、肺和心脏中同样克隆到GLP-1受体[7]。GLP-1受体激动剂多样的生物学特性是利用此类药物开发治疗各类糖尿病及其并发症新药的重要理论基础[8]。因此，建立高通量筛选细胞模型，从潜在的具有降糖作用的天然产物以及小分子化合物库中寻找兼具靶向性、大规模、快速有效等特征的GLP-1受体激动剂，成为了研究开发糖尿病及其并发症药物的新方向。
根据G蛋白偶联受体(GPCR)的信号通路特性，其高通量筛选模型大致可以分为三类：第一类是基于受体配体结合检测的分析方法；第二类是基于第二信使检测的分析方法，包括cAMP的酶联免疫ELISA分析、Ca2 测定等；第三类是基于受体功能反应的报告基因测定法。在这三类方法中，基于受体功能反应的报告基因检测方法易于区分激动剂和拮抗剂，而且与传统的受体功能检测法相比,基于重组技术的报告基因检测法具有灵敏、操作简单、节省成本等优点，是筛选受体激动剂和拮抗剂的最有效也是最常用的方法[9]。
综上，本课题选用报告基因检测法，拟将GLP-1受体基因与报告基因相偶联，即将GLP-1受体基因和报告基因共转染到CHO-K1细胞株中，建立一个稳定的表达的GLP-1受体细胞株，用以筛选GLP-1受体激动剂，为新药研制打下坚实基础。
二、实验目的及意义
本课题研究旨在采用质粒构建、脂质体共转染及加压筛选等手段，建立稳定、高效、特异响应GLP-1受体信号通路的活性药物筛选细胞模型，同时进行模型的验证及筛选条件的优化。以期建立以荧光素酶报告基因检测的GLP-1受体激动剂的细胞筛选系统，为靶向GLP-1R的新药研制做初步研究。
三、实验方法
1、稳定表达GLP-1受体及荧光素酶报告基因的细胞株的建立
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