去泛素化酶USP7 TRAF域原核表达载体构建及蛋白纯化
一前言
1.1泛素-蛋白酶体系
泛素-蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system，UPS）普遍存在于真核生物体内，主要由泛素（ubiquitin，Ub）、泛素活化酶（ubiquitin activating enzyme，E1）、泛素结合酶（ubiquitin conjugating enzyme，E2）、泛素连接酶（ubiquitin ligase enzyme，E3）、去泛素化酶（deubiquitinase，DUB）和蛋白酶体（proteasome）等六个部分组成。[1]UPS调节真核生物体内大部分蛋白质的降解、相互作用，干扰定位，在细胞信号传递和分裂和增殖中发挥重要作用。
泛素是一种小分子蛋白质，它能在泛素活化酶的催化下，以单体或链的形式与底物蛋白相连接，这个过程称为底物蛋白泛素化修饰。底物蛋白在泛素化酶的作用下可发生不同类型的泛素化。发生单泛素化后，含有多个氨基酸残基的底物蛋白上在合适条件下可发生多位点单泛素化；底物蛋白还可以在单个位点发生多聚泛素化，由于泛素含有7个赖氨酸残基，所有这些残基都可以与其他泛素连接，形成不同结构的泛素链。这些反应共同介导了组蛋白调控、DNA损伤修复、逆转录病毒出芽及胞吞等生物过程[2]。蛋白质的泛素化修饰是一个可逆的过程，泛素化蛋白可在去泛素化酶（Deubiquitinase，DUBs）的作用下发生去泛素化。DUBs能够水解结合位点的酯键、肽键或异肽键，从底物蛋白质或多聚泛素链中去除泛素，逆转非降解性泛素信号，保持底物蛋白的稳定性，重新释放泛素分子。
DUBs数量庞大，目前人类基因编码了至少99种去泛素酶，被分为七个不同的亚家族，其中六个亚家族是半胱氨酸蛋白酶，它们分别是泛素特异性蛋白酶家族、泛素C末端水解酶家族、卵巢癌蛋白酶家族、含有马查多-约瑟芬结构域蛋白酶家族、含泛素的新型DUB家族相互作用的基序家族以及最新发现的含有UFM1特异性肽酶结构域蛋白的锌指家族，金属蛋白酶家族目前只有JAMM/MPN结构域相关金属蛋白酶家族[3][4][5]。虽然这些酶各不相同，但它们的催化结构域都是由泛素结合位点和多泛素链的远端泛素结合位点组成。泛素化修饰物的C-末端都含有Gly-Gly基序，能与DUBs的残基作用发生去泛素化水解。去泛素化反应影响着底物蛋白质的稳定性、酶活性或亚细胞定位，与泛素化修饰在多种生理病理过程中具有重要的协同作用，影响着肿瘤的发生发展。目前针对DUBs活性的多种有效抑制剂已经被开发出来，并在临床前模型中显示出良好的抗癌效果，DUBs已经成为这些疾病非常有前景的治疗靶标.
泛素特异性蛋白酶(USP)是DUBs家族中数量最大、结构最多样的去泛素化酶家族，其成员数量超过50个。其中USP7作为调控癌症的一个靶点，成为近年来研究最热门的USPs之一。
1.2 USP7结构
泛素特异性蛋白酶7（ubiquitin-specific protease 7，USP7）又称为疱疹病毒相关性泛素特异性蛋白酶（herpesvirus-associated ubiquitin specific protease, HAUSP）；USP7全长1102个氨基酸，分子量为135kDa，包含三个主要的结构域：N端类TRAF域（Tumor necrosis factor Receptor-Associated Factor，TRAF，residue 62-205）、中心催化域（catalytic domain，CD，residue 208-560）和C端UBL域（C-terminal domain，CTD，residue 560-1102）[6]。这些结构域含有不同靶蛋白的结合位点，能发挥不同的作用。TRAF结构域和C端UBL结构域都具备识别的能力，能够识别不同的USP7底物，其中C端结构域含有两个泛素连接酶，能与泛素相互作用，是增强USP7催化活性的关键；而中心催化域CD包含两个高度保守的组氨酸盒和半胱氨酸盒，是泛素蛋白酶家族的重要特征。USP7具有灵活的空间构象，正是因为其独特的动态双域结构，这种灵活的空间构象对于调节USP7的酶活性具有重要作用。
中心催化域CD位于类TRAF结构域和UBL结构域之间的中心位置，其构象类似于人的右手，可分为三个区域: 拇指区（Thumb）、手掌区（Palm）以及四指区（Fingers），其中与泛素相结合的疏水空腔位于拇指区和手掌区交界处，由许多酸性氨基酸构成[7]。Cys223、His464和Asp481三者一起构成催化中心的催化三联体，是USP7发挥酶活性的关键所在。Asp481限制了His464的侧链旋转，导致其极化，极化后的His464使Cys223的巯基去质子化并引发其对泛素和底物之间的异肽键的亲核进攻，切割泛素和底物之间的异肽键[8]。
USP7 C端结构域由5个UBL域（ubiquitin-like domain）构成。其中，UBL1与UBL2紧密连接，UBL4与UBL5紧密连接，而UBL3通过灵活的Linker与UBL2和UBL4隔开[9][10][11]。不同USPs成员的UBL结构域分布位置是各不相同的，有的结构域会嵌入催化域中，有的结构域位于USPs的N端或C端。尽管USPs蛋白家族中各成员的UBL域存在不同，但在功能调节作用上也存在一定的共性：他们可间接抑制或增强酶的活性，或者直接作为蛋白酶体调节USPs的催化活性。
类TRAF结构域具有特征性的八链反向平行beta;-三明治折叠，其功能主要是与USP7底物蛋白特异性结合，影响蛋白和蛋白之间的相互作用[12]。抑癌蛋白p53是第一个被发现与类TRAF结构域特征性结合的底物。近年来越来越多结合在此区域的其他底物蛋白被陆续揭示。所有的这些底物蛋白虽然各不相同，但都含有能与类TRAF域表面的浅凹槽识别的基序。这些底物蛋白之间竞争性地与USP7结合。例如抑癌蛋白p53和其E3泛素连接酶MDM2，两者竞争结合USP7，在调控细胞中的p53水平发挥着关键性作用。
1.3 USP7的生物学功能
1.3.1调控细胞周期
USP7调控有丝分裂检查点蛋白的稳定性，参与纺锤体检查点装配和信号转导。有丝分裂SAC是基因组稳定性的基础，USP7能与SAC的关键成分之一相互作用并使其保持稳定性，抑制APC/C的泛素连接酶活性[13]。当USP7被抑制或减少时会延长有丝分裂周期，同时会导致SAC关键成分失稳从而不能被正确激活，使得有丝分裂异常，最终导致基因组不稳定，出现微核积累和非整倍体增加的现象。
1.3.2调控表观遗传修饰和染色质重塑
USP7参与基因表达的表观遗传调控，与染色质重塑的的多种蛋白质息息相关。DNA甲基化的调节因子UHRF1和甲基转移酶DNMT1是USP7的底物，UHRF1能够读取DNA甲基化并与将其与组蛋白表观遗传标记联系起来，在复制过程中维持DNA甲基化；UHRF1在细胞增殖过程中表达，USP7调节UHRF1的泛素化修饰，UHRF1被磷酸化后从USP7中被释放降解。USP7与DNMT1形成复合物，并刺激DNMT1的DNA甲基化活性，USP7/DNMT1复合物与染色质上的UHRF1形成三聚体复合物[14]，发挥协同作用调节DNA的甲基化。表观遗传由DNA甲基化和组蛋白泛素化修饰共同调节，从而调节染色质重塑；调控染色质重塑控制了染色质的状态是开放还是封闭，决定转录基因的激活或是抑制染色质状态[15]。
1.3.3介导DNA损伤反应和DNA修复
DNA损伤反应(DDR)是一种信号级联反应，可以识别检查DNA损伤，发挥修复 DNA 的功能，从而保持基因组的稳定性。USP7主要通过四种途径来介导DDR反应和DNA修复：调控参与应答过程中关键蛋白的细胞水平，例如抑癌蛋白p53，它所调控的细胞凋亡在DDR应答过程中是非常重要的一环；调控核苷酸切除修复（nucleotide excision repair，NER）途径，USP7能与DNA损伤识别因子XPC蛋白相互作用，启动核苷酸切除修复；调节DNA损伤应答通路，USP7是DDR检查点激酶 1 (CHK1)所必需的关键适配蛋白，并促进 ATR (ATM-Rad3-Related)介导的CHK1磷酸化[16]，启动修复；调控DNA损伤的耐受性，调控泛素化修饰促进了特定的DNA跨损伤复制，使DNA复制完整进行。
1.4 USP7与肿瘤信号通路
P53、PTEN和FOXO是目前最重要的三种肿瘤抑制剂，USP7通过与它们结合或者作为调节剂在各类信号通路中发挥作用。
抑癌蛋白p53介导的信号网络对维持细胞内环境平衡至关重要，鼠双微体 2 (mouse doubleminute 2，MDM2) 是 p53 的主要负调控因子之一，MDM2 可以通过多种途径抑制 p53 的活性，例如，MDM2通过介导p53的泛素化使其被降解；MDM2与p53 N-末端的转录活化区结合，使得p53的转录活性直接被抑制[17]。USP7是MDM2和P53的特异性双激酶，通常情况下USP7优先与MDM2结合，但在DNA损伤的情况下，USP7与MDM2结合下降导致其被降解，减弱对p53的抑制作用，从而发挥抑癌蛋白p53在癌细胞中作用，因此p53-MDM2通路成为药物治疗研究热点。
瘤抑制基因磷酸酶和张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog，PTEN)是人类肿瘤细胞中最常见的突变/缺失或沉默的肿瘤抑制因子之一[18]。PTEN一般存在于细胞核和胞浆中，它的核质穿梭能力和定位能力对于抑制肿瘤功能和维持基因组完整性是必不可少的；PTEN拮抗胞浆中的PI3K-AKT通路，在细胞核中通过增强APC-Cdh1功能抑制细胞增殖[19]。USP7是PTEN去泛素化酶，磷酸化使得两者的相互作用增强。而USP7的异常表达可能使PTEN的功能或定位异常，抑制USP7活性可刺激PTEN的核聚集，进而促进癌细胞凋亡。
FOXO(Forkhead Box O)家族的转录因子包括FOXO1、FOXO3、FOXO4和FOXO6，在细胞增殖、氧化应激反应和肿瘤发生等多种生理过程中发挥调节作用[20]。在抑制细胞恶性增殖，促进肿瘤细胞凋亡以及阻碍癌细胞转移等过程中，FOXO4被发现具有转录活性，对肿瘤的发展具有抑制作用。单泛素化的FOXO4定位于细胞核内，拥有较高的转录活性。USP7是FOXO4的负调控因子之一，去泛素化会导致FOXO4从细胞核转移到细胞质，从而失去转录活性。
USP7在肝癌、肺癌、前列腺癌等多种类型的肿瘤中高表达，介导多种信号通路调控肿瘤的发生发展。敲除/敲降肿瘤细胞中USP7或抑制USP7活性，均能抑制肿瘤生长。因此，USP7是非常具有潜力的抗肿瘤新靶点。人们目前也在积极寻找更多与USP7相互作用的蛋白质和分子靶点。
1.5 USP7的化学干预
现在已报道的USP7抑制剂大都作用于催化域，早期发现的HBX41108、P5091等化合物，对USP7的抑制活性和选择性均较差[21]。2017年后，一系列活性强、选择性高的哌啶醇化合物（如FT671、Almac4）及其与USP7催化域蛋白的共晶结构被报道[22][23]。而关于USP7 TRAF域的调控剂只有肽类vif1被报道过，vif1以p53依赖的方式显著抑制肿瘤生长，但具体的作用机制并不清楚。目前尚无文献报道作用于USP7 TRAF域的小分子化合物。2019年，日本学者报道基于USP7 TRAF域的底物结合位点进行化合物虚拟筛选，但未给出任何生物学实测数据[24]。
USP7 N端类TRAF域主要功能为底物蛋白识别和结合，因此探寻USP7类TRAF域与底物蛋白的相互作用力，将有望设计出可以特异性抑制USP7 N端底物蛋白去泛素化的小分子。本课题通过构建USP7 TRAF域原核表达载体，诱导重组载体蛋白表达纯化，为探寻TRAF域的小分子抑制剂奠定基础。
二．研究内容
本课题选取重叠延伸PCR技术进行目的基因载体构建。在插入目的基因片段的正/反向扩增引物5端引入线性化载体的末端序列，使得目的扩增物5和3最末端分别带有和空载化载体两末端一致的序列。PCR产物和线性化载体在重组酶的催化下按照比例进行反应，完成定向克隆。本课题采用Vazyme公司的ClonExpress Ultra One Step Cloning Ki试剂盒，具有简单、快速并且高效的DNA无缝克隆优点。
体外重组蛋白表达技术是生物领域中被广泛地使用，原核表达系统、酵母表达系统是使用较多的表达系统，还有两种：哺乳动物细胞表达系统和昆虫细胞表达系统使用较为局限。原核表达系统具有操作简单、 周期短、成本低，外源基因表达产物水平高，基因背景和表达特性清楚的优点。选择带有合适标签的表达载体有助于构建载体的后续处理，例如蛋白的纯化过程中，帮助提高蛋白的可溶性，同时不能影响蛋白的结构功能和下游应用。本课题选择了pGEX-6p-1表达载体。pGEX-6p-1表达载体含一个GST标签，大小为4.9 Kb，含有氨苄抗性基因，具有增强蛋白可溶性，屏蔽毒性蛋白等优点，但标签较大，易影响重组蛋白结构，后续需进行标签酶切。
由pGEX-6P-1-hUSP7 CTD（提供载体骨架）和pEGFP-N1- hUSP7 full-length（提供目的基因）两个质粒通过单片段同源重组获得。线性化pGEX-6P-1-hUSP7 CTD，PCR扩增目的片段，检验产物有无后，利用同源重组技术将两个片段分别插入到pGEX-6p-1表达载体中，进行重组产物转化、涂板、挑克隆、测序，测序正确后选取USP7 TRAF提取质粒，大批培养，诱导GST标签的USP7 TRAF蛋白表达纯化，最后用考马斯亮蓝技术检测目的蛋白。
-
进度安排1.2021.3-2021.4：查阅相关文献，撰写开题报告，载体构建完毕
2.2021.4-2021.5：蛋白表达纯化3.2021.5-2021.6：整理数据，毕业论文撰写完成
剩余内容已隐藏，您需要先支付 10元 才能查看该篇文章全部内容！立即支付
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
