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研究背景：
内参基因［1］：内参即是内部参照，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测基因的表达水平变化时常用它来做参照物。其作用是校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。一般要选择一个在处理因素作用的条件下不会发生表达改变的基因作内参。
在进行基因研究的过程中实时反转录PCR也和传统的mRNA定量方法如Northern blot技术等一样要求使用参照基因以校正转录效率和cDNA用量弥补制备过程中样本纯度和浓度的差别使不同样本之间目的基因的比较成为可能以期获得真实可靠的结果。大多数分析方法中这些差别可通过与内参照比较处理消除。
近年来的研究发现：这些常用内参基因均存在缺陷，在不同类型的细胞和组织细胞增殖和器官发育的不同阶段体外培养各种实验条件等情况下它们的表达量通常变异较大。正确的选择内参基因很大程度上依赖所研究的细胞或组织,不同的试验需要寻找适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而,合适内参基因的选择,需要在各种类型的细胞或组织和各种试验条件下进行比较选择。理想的内参基因应在各种试验条件下,各种类型的组织和细胞中均恒定表达,而且其表达量是近似的,无显着性差别。另外要求不存在假基因以避免基因组的扩增。
常用的内参基因包括：
PPIA［2］、MRPL19、TBP、GAPDH、β-actin(BETA-actin)、18sRNA、28sRNA、B2M、ACTB、SDHA、HPRT1、ARBP内参基因等。
软件的应用：
GeNorm:如何利用GeNorm软件筛选基因表达测定的内参基因?［3］
随着实时荧光定量PCR成为检测基因表达谱的高通量、高精度的方法，基因表达分析在生物学研究中得到广泛应用。采用稳定的内参基因对反应进行标准化可以增加该方法的敏感度、重复性和动态范围，理想的内参基因在所研究的组织、细胞和实验条件下均恒定表达。管家基因是维持细胞最低限度功能不可少的基因，在所有类型细胞中都表达，是广泛应用的内参基因。但是，很多研究表明管家基因在不同组织、细胞以及不同条件下表达量并非永远恒定，甚至差别很大，至今尚未发现在所有条件下均恒定表达的管家基因。因此，对特定基因表达研究中候选管家基因的表达稳定性进行评价，筛选出最为稳定的管家基因作为内参基因，对保证研究结果的真实、可靠至关重要。
Vandesompele等(2002年)开发了GeNorm这一用于微软Excel平台的VBA宏程序，用于荧光定量PCR中候选内参基因的稳定性评价及确定合适的内参基因数，该程序可从互联网上免费下载。其依据的原则是两个理想内参基因表达水平的比值应该在所有标本中一致，不论在何种实验条件或者细胞类型。该法不受基因间表达丰度差别和极端比值的影响，比值变异度的增加意味着二者中其一或全部基因表达稳定性的降低。通过计算某一基因与其他所有基因间两两比值的对数转换值的平均变异度M作为基因稳定性的评价指标，即：首先将荧光定量PCR得到的循环阈值(Ct)转换为相对定量数据，方法是找到最低Ct值的基因(表达量最高)，用所有其他基因的Ct值减去最低Ct值，得到△Ct，其值≥0，每个基因相对于最高表达水平基因的相对表达量为2∧-△Ct。然后制作Excel表格，列标题为标本名称，行标题为基因名称，将计算得到的各标本各个基因的2∧-△Ct数值输入表格。将该文件保存到GeNorm安装文件夹下，关闭所有Excel程序。启动GeNorm程序，根据操作说明点击自动分析按钮，程序自动给出M值折线图，该图显示了逐步去除最不稳定表达的内参基因过程中每一步骤各内参基因平均表达稳定性数值M，M值越小，基因表达越稳定，该图对各管家基因稳定性进行了排序。再次点击自动分析按钮，将给出配对变异分析Vn/n 1结果图，该图显示了需要选择内参基因的数目，建议V0.15为选择阈值，如V2/30.15，表明只需选择2个内参基因作标准化指标。利用该程序，研究者可以对特定研究的多个管家基因进行筛选，选出2个以上管家基因作为内参，有助于校正系统偏差以得到更可靠的结果，这对于基因的准确定量，尤其是细小表达差异的基因表达研究具有极其重要的价值。
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