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根据现代量子理论观点,能级的离散和不同能级间的跃迁是微观系统的基本特征。分子属于一种微观物质,常态下处于其体系的最低能量状态而不对外界释放能量,称之为基态;当其受到外界能量激发而跃迁到高于基态的激发态时,根据物质能够稳定存在的最低能量原则,分子有回落到最低能量状态的趋势,并在此过程中释放出多余的能量。在释放能量的过程中如果能量是以可见光的形式放出的,那么这种分子在外界能量激发下所发出的可见光称之为荧光;如果激发能量为紫外-可见光源,则称此发光过程为光致发光。利用物质作用前后荧光变化来达到特定分析目标的技术称之为荧光分析技术,光致发光是最常用的一种方式。由于荧光分析的高灵敏和高选择性,并能提供丰富的光谱信息,在分析化学、生物化学、环境科学、材料科学、医药等领域具有广泛的应用前景。
超分子化学的飞速发展极大的丰富了分子识别的概念。分子识别是自然界一切生命现象的共同基础,是有目标的结合,它是通过一系列结构确定的分子间相互作用而组成的模式识别过程[1]。识别过程可能引起体系的光学、电学、颜色等性质的变化,这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。在分子识别领域中,具有分子器件性质的荧光探针通过与目标物质选择性键合,结合前后的很多荧光参数发生变化。这种微观领域的相互作用通过荧光信号表现出来,从而实现在分子水平上的原位实时检测[2],达到对金属离子、有机分子、生物大分子等很多物质的特效识别。
由此,利用分子识别引起识别作用发生前后体系荧光的变化以达到特定的分析目的的技术称为荧光分子探针技术。分子识别的目标物可以是金属阳离子、中性分子和阴离子等。由于金属阳离子在生物生命活动中的重要性,针对金属阳离子的荧光分子探针的检测目标一直引起科研人员的兴趣。目前常见的金属离子荧光试剂主要有席夫碱、冠醚、荧光素、罗丹明、腙类、蒽酮类、羟基哇啉等类型。
罗丹明是一类咕吨类染料,由于在不同的pH介质中会结合质子而呈阳离子状态存在于溶液中,所以也称罗丹明染料为碱性染料。其中最著名的是罗丹明B,除此之外,还包括罗丹明G,罗丹明123,罗丹明110。罗丹明B具有高的摩尔吸收系数和较大的荧光量子产率,水溶性好,无毒,制备成本低等优点。因此,罗丹明B及其衍生物是一类较好的荧光探针,在研究生物分子结构及功能,核酸杂交分析和免疫等方面得到广泛的应用。由于分子内苯环间是以氧桥的连接,使分子具有刚性共平面结构,分子结构稳定性增强,在激发光的作用下产生强烈的荧光。在可见光区,它们是一类非常好的荧光染料。其单体水溶液能发出很强的荧光,在不同的溶剂、pH值、温度和浓度条件下,罗丹明染料在溶液中主要有以下几种存在形式:中性分子、离子形式、内酯、二聚体或四聚体。如下图所示,罗丹明B在酸性条件下,以醌式(quinoneform)结构存在,有荧光,而在中性或碱性条件下,形成螺环(spirolaetamform)结构,荧光减弱至消失。
近年来,罗丹明的内酰胺螺环状结构成为研究的热点:罗丹明的内酰胺螺环状结构,在长波长处无荧光吸收,无色:如果改变内酰胺螺环状结构,它的荧光性质发生改变,即在长波长处有强的荧光吸收,有颜色。由于罗丹明类化合物结构具有易修饰的特点,罗丹明内酰胺类化合物具有形成OFF-ON"型荧光探针的潜能。一般以罗丹明作为母体进行设计,使它形成具有酰胺螺环状结构的化合物,此时它是在长波长处无吸收,无色,无荧光,当它与底物相互作用的时候,内酰胺螺环状结构被破坏而打开,这时它在长波长有吸收,有颜色,强荧光。利用此原理对罗丹明进行设计合成探针分子,此类探针已被用于许多金属离子、生物活性物质及生物分子的检测。
罗丹明内酰胺类荧光探针对金属离子的选择性识别,实质就是金属离子与探针分子产生络合作用,诱导探针的螺环结构打开,从而产生荧光信号。此类探针的诱导开环机理存在两种形式:一种是不可逆开环,金属离子通过与探针分子络合诱导螺环打开,从而发生化学反应,形成新的能发出荧光信号的化合物。另一种是可逆开环,通过金属离子与探针分子络合,诱导螺环打开,形成发出荧光的醌式结构,如有更强的络合剂与金属离子结合,此过程则向逆方向进行。
2007年,Xiang[3]等研究发现室温下罗丹明B酰肼在酸性条件下可用于检测Cr6 的浓度,检出限低,样品检测实验结果表明,此探针对于饮用水中Cr6 含量的的检测具有重要应用。
2009年,Chen[4]等设计合成了探针2,该探针对Cu2 具有较高的选择性和灵敏度识别。并通过加入竞争性试剂,证明该过程是不可逆的。
2005年,JinsungTae[5]等人利用汞离子催化氨基硫脲形成1,3,4-噁二唑酮的原理合成一种新的荧光探针,可用于检测汞离子。该荧光探针具有较快的响应时间,向溶液中加入汞离子后,溶液瞬间变成红色,并产生黄色的荧光。
Zhang[6]等以罗丹明6G为基础,研究合成了探针8。Fe3 的加入引起罗丹明的螺环结构打开,体系呈现出明显的荧光增强。
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