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毕业论文课题相关文献综述
CRISPR/Cas9基因敲除系统
1. 基因敲除
基因敲除(knockout)是指一种遗传工程技术，针对某个序列已知但功能未知的序列，改变生物的遗传基因，令特定的基因功能丧失作用，从而使部分功能被屏障，并可进一步对生物体造成影响，进而推测出该基因的生物学功能。基因敲除和基因嵌入技术是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。基因嵌入又称基因置换，它是利用内源基因序列两侧或外面的断裂点，用同源序列的目的基因整个置换内源基因。功能基因组学的研究进展使基因敲除技术显得尤为重要。基因敲除技术从载体构建到细胞的筛选到动物模型的建立各方面都得到了发展,此外,进退策略、双置换法、标记和交换法、重组酶介导的盒子交换法也从不同方向发展了基因敲除技术[1]。
2. TALENs和ZFN技术
TAL效应因子（TAL effector, TALE）最初是在一种名为黄单胞菌（Xanthomonas sp.）的植物病原体中作为一种细菌感染植物的侵袭策略而被发现的[2]。这些TALE通过细菌 III类分泌系统（bacterial type III secretion system）被注入植物细胞中，通过靶定效应因子特异性的基因启动子来调节转录，来促进细菌的集落形成。由于TALE具有序列特异性结合能力，研究者通过将FokI核酸酶与一段人造TALE连接起来，形成了一类具有特异性基因组编辑功能的强大工具，即TALEN。过去的几年中，人工设计的核酸TALENS被广泛用于有针对性的植物如arabido基因组的修饰[3]。
锌指核酸酶（Zinc-finger nuclease, ZFN）又名锌指蛋白核酸酶（ZFPN），它是一类人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域（zinc finger DNA-binding domain）与限制性内切酶的DNA切割域（DNA cleavage domain）融合而成。研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。此外，通过将锌指核酸酶技术和胞内DNA修复机制结合起来，研究者还可以自如地在生物体内对基因组进行编辑。目前，在大量植物、果蝇、斑马鱼、蛙、大/小鼠及牛等物种中，ZFN技术已被广泛应用于靶向基因的突变，通过人工修改基因组信息可以产生遗传背景被修改的新物种。该技术在医学领域也具有非常重大的价值，对于疾病的基因治疗有潜在意义，具有非常广泛的应用前景[4]。ZFN技术作为一种基因组修饰工具,具有高效、特异及适用性广泛的特点,近年来发展迅速,已成功应用于多种有机体及细胞类型的基因敲除。ZFN由一个非特异的Fok Ⅰ核酸内切酶DNA切割结构域和一个特异性的DNA结合结构域构成。ZFN进入细胞后可在基因组定点产生双链断裂,通过细胞对基因组DNA的自我修复途径可使基因打靶效率提高几个数量级[5]。
3. CRISPR/Cas9系统
近年来发展起来的人工合成的DBDs,如ZFs(Zinc fingers)或TALEs(Transcriptional ac-tivator-like effectors)是精确调控靶基因表达研究的主要技术,但是这些技术耗时、耗力,并且对实验室的技术要求也比较高[6]。CRISPR/Cas9系统是2012年发展起来由RNA导向的基因组编辑技术。相比ZFN和TALENs技术,CRISPR/Cas9系统具有类似的打靶效率,且更易于操作[7]。CRISPR是一种来自细菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫机制。在细菌及古细菌中，CRISPR系统共分成3类，其中Ⅰ类和Ⅲ类需要多种CRISPR相关蛋白（Cas蛋白）共同发挥作用，而Ⅱ类系统只需要一种Cas蛋白即可，这为其能够广泛应用提供了便利条件。CRISPR／Cas系统广泛存在于细菌及古生菌中，是机体长期进化形成的RNA指导的降解入侵病毒或噬菌体DNA的适应性免疫系统[8]。
目前，来自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。
由于PAM序列结构简单（5-NGG-3），几乎可以在所有的基因中找到大量靶点，因此得到广泛的应用[9]。近年来,随着人们对CRISPR-Cas系统研究的不断深入和改造,CRISPR-Cas系统已成为一项新的基因靶向修饰技术,能够定向对靶基因进行定向沉默,目前该项技术已经成功地用于HEK293、小鼠及斑马鱼的细胞并产生了稳定的基因敲除细胞株,在小鼠、果蝇等模式动物上成功构建了基因敲除模型。CRISPR-Cas以其设计简单,耗时短、效率高等优点使其成为一项具有广阔应用前景的基因靶向敲除技术[10]，CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。
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