选择和分析小檗碱的DNA适配体，以开发一种无标签的发光荧光探针
适配体是短的单链DNA或RNA，可以在体外通过指数富集的配体系统进化技术(SELEX)从随机组合文库中选择。为了获得新的小檗碱选择性发光配体，我们利用改进的亲和层析技术筛选了小檗碱的DNA适配体。通过与生物素标记的互补寡核苷酸捕获链杂交，将ssDNA文库偶联到链霉亲和素包被的琼脂糖珠上，通过小檗碱结合释放出琼脂糖珠中的适配体序列。通过与生物素标记的互补寡核苷酸捕获链杂交，将ssDNA文库偶联到链霉亲和素包被的琼脂糖珠上，通过与小檗碱结合释放出琼脂糖珠中的适配体序列。该方法简单、直观、有效，仅经过6轮筛选就得到3个微摩尔解离常数(Kds)较低的适配体。通过研究小檗碱-适配体对的发光现象，最终得到的21-适配体具有比G四聚体结构更高的荧光增强能力，可作为一种新型的发光荧光探针用于各种生物传感应用。
导言
G-四链体(G4)是一种独特的核酸四链结构，由富含鸟嘌呤序列经Hoogsteen氢键而成的堆积鸟嘌呤四链体组成。1–3 最近，G4形成的寡核苷酸因其在体内的潜在生物学功能而受到广泛关注，4,5 以及通过基于G4的荧光或发光探针在其他生物分子的无标记检测中的应用，6–11 特别是基于G4的发光荧光探针。发光染料如菁染料，卟啉染料，三苯甲烷染料等12–15 表现出极好的荧光性能，虽然其自身荧光性能非常低，但当其与G4相互作用时会增加很多。由于这一特性，基于G4的发光荧光探针已被广泛用于设计无标签生物传感器，用于检测金属离子、小分子、核酸、蛋白质、癌症细胞等。7-11，16 但G4的构象容易受到G-四联球菌叠放的数量、环的组成、准备方式等因素的影响。此外，G4结构可以与金属离子、小分子和蛋白质等相互作用，这限制了基于G4发光荧光探针的应用。因此，有必要开发具有更高特异性和选择性的新型荧光配体。
核酸适配体是短单链DNA(ssDNA)或RNA，它能以高特异性和亲和力与特定靶标结合，并能在体外被SELEX（指数富集配体的系统进化)筛选。17–19 自1990年以来，从小分子到复杂靶标的适配体被选择，一些研究者尝试选择发光染料的适配体来替代G4。20–23 Tsien小组首次表明孔雀石绿(MG)的荧光在与其特异性RNA适配体结合后显著增强24。将MG-适配体对进一步设计为信号探针，用于检测小分子和核酸。25,26 然而，到目前为止，仅选择了几种用于发光染料的RNA适体，例如MG，Hoechst衍生物和二甲基吲哚红（DIR）。20–22 RNA适体因其造价高、易降解等特点，对生物传感器的构建具有一定的不利影响。Yasuhiro Aoyama和他的同事为Hoechst衍生物选择了DNA适体，并设计了一种策略来产生发光的荧光体适体对，使我们能够检测目标核酸序列。23 Bowser团队利用毛细管电泳指数富集的配基系统进化技术来筛选NMM的DNA适配体，并研究了其对金属插入反应的催化性能。27 虽然这些适配体用于生物传感器的开发，但仍存在一些因素，如紫外光激发或长DNA序列，阻碍了这些适配体的广泛应用。
小檗碱是一种植物生物碱染料，曾从中草药中分离出来，最初被用作抗微生物剂。28,29 小檗碱及其衍生物因其与G4的结合能力和对端粒酶的高抑制活性而受到广泛关注，最近也有报道称其为G4发光荧光探针。30–36 游离小檗碱在水溶液中具有微弱的荧光，但在与G4结合时具有很强的荧光。据我们所知，到目前为止，指数富集的配基系统进化技术还没有筛选出针对小檗碱及其衍生物的适配体。本研究采用改良的亲和层析法对小檗碱DNA适配体进行筛选。通过与生物素标记的互补寡核苷酸捕获链杂交，将ssDNA文库偶联到链霉亲和素包被的琼脂糖珠上。在与小檗碱培养后，与小檗碱结合亲和力强的序列会从琼脂糖珠中释放出来，而结合较弱或没有结合的序列仍然固定在琼脂糖珠上。通过聚合酶链反应扩增富集的ssDNA库，并使用链霉亲和素包被的琼脂糖珠和碱性变性形成新的ssDNA库，来用于下一轮筛选。经过6轮筛选，获得3个微分子解离常数(Kds)较低的适配体。进一步优化了其中的最佳适体，缩短后的适体显示出与全长序列相似的Kds。本文还对荧光基团-适配体对的发光现象进行了研究，最终得到的具有比G4结构更高荧光增强能力的短21聚体将作为一种新型的发光探针。
实验
材料
小檗碱购自Sigma-Aldrich公司(美国)。链霉亲和素琼脂糖珠购自Thermo Fisher Scientific(美国)。BL21大肠杆菌购自美国ATCC公司。20 bp DNA标记、6times;装载缓冲液、10times; PCR缓冲液、脱氧核苷酸三磷酸(dNTPs)、rTaq聚合酶、pMD18-T载体克隆试剂盒购自Takara Biotechnology(大连，中国)。分子探针SYBR Green I购自Invitrogen Technology(上海，中国)。琼脂糖购自Biowest(西班牙)。所有其他化学试剂都是分析级的。所有实验均使用超纯水(18.2 MOmega; cm)。
SELEX文库和引物
ssDNA文库包含30个核苷酸(nt)的中心随机序列，两侧是18-核苷酸和25-核苷酸引物杂交位点，命名为Lib-30N-berb:5rsquo;-GGAGGCTCCGGGACGAC-N30-GTCGTCCCGATGCTGCAATCGTAAGAAT-3rsquo;。PCR反应采用正向引物P1-berb:5rsquo;-GGAGGCTCTCGGGACGAC-3rsquo;、反向引物P2-berb: 5rsquo;-ATTCTTACGATTGCAGCATCGGGAC-3rsquo;、生物素标记反向引物Bio-P2-berb：5rsquo;-Bio-ATTCTTACGATTGCAGCATCGGGAC-3rsquo;合成双链DNA (dsDNA)分子。在碱性条件(0.15 M NaOH)下变性后，通过链霉亲和素包被的琼脂糖珠将ssDNA适配子与生物素化的ssDNA链分离，并用于下一轮筛选。将与P1-berb互补的生物素标记DNA捕获-berb: 5rsquo;-GTCGTCCCGAGAGCCATA-Bio-3rsquo;与链霉亲和素包被的琼脂糖珠结合，制备亲和柱。文库和引物均由Sangon生物技术(上海)有限公司(上海，中国)合成。
使用聚合酶链反应扩增和随后的凝胶电泳成像来监测筛选过程。
以上是毕业论文文献综述，课题毕业论文、任务书、外文翻译、程序设计、图纸设计等资料可联系客服协助查找。
