文 献 综 述 1.研究现状： 藏红花作为传统妇科良药在欧洲和亚洲已得到广泛应用, 又可用于功能性食品和保健性化妆品的开发。研究还发现藏红花柱头中藏红花素、藏红花苦素等活性成分具有良好的抗癌作用, 能够从分子水平上抑制肿瘤的形成, 有望成为21世纪最理想的抗癌药物之一。但藏红花只是柱头入药, 产量极低; 又因为其资源极其有限, 致使其价格每公斤2000美元左右, 被誉为植物黄金, 通过植物细胞工程筛选产藏红花素的细胞进行规模化培养是解决藏红花资源短缺的有效途径之一。 我国藏红花的栽培生产主要采用室内栽培、收获鲜花的方法，在栽培条件下不能结实，主要靠球茎繁殖，而在栽培过程中球茎越种越小，小球茎开花少且花小，甚至不开花，从而失去药用价值。随着组织培养技术在药用植物上的广泛应用，我国藏红花的愈伤组织及小球茎诱导技术也得到发展，为大量培养优良的藏红花种质资源提供了研究基础。对我国藏红花的离体快繁技术进行综述，为建立高效稳定的藏红花离体快繁体系提供参考。内生真菌在与宿主长期进化的过程中, 宿主可能将其遗传物质或信息传递给内生真菌, 使内生真菌具有和宿主相同或类似的代谢途径,并产生某些与宿主共同的代谢产物。 为了获得产藏红花素的藏红花愈伤组织, 陈书安等对藏红花愈伤组织进行了系统诱导, 建立了目视和HPLC相结合筛选细胞系的方法, 并应用该方法从229株细胞系中筛选出细胞系Corm1, 其藏红花素1的含量是1. 67mg / g, 生长快、不易褐化。George 等研究表明, 不仅在藏红花愈伤组织中含有藏红花素物质, 在栀子花的愈伤组织中也检测到了一定量的藏红花素,为了考察栀子愈伤组织生长和其藏红花素的含量情况, 对栀子叶子和种子愈伤组织的进行了筛选, 并通过目视和HPLC相结合的方法对产藏红花素栀子愈伤组织进行了筛选。 2. 产藏红花素细胞系的筛选 在植物细胞培养规模化生产次生代谢产物的过程中, 会面临生长缓慢, 次生产物含量低以及细胞系不稳定等问题, 解决这些问题的基础是细胞株系的筛选, 因此建立一种简便、快速和有效的高产藏红花素细胞系的筛选方法并从大量的细胞系中筛选出藏红花素含量高、生长快速并不易褐化的细胞系是规模化生产藏红花素的关键。高产细胞株系筛选的一般流程为: 选择合适的材料, 从不同来源的材料建立细胞培养物, 获得大量的细胞系, 然后从中选择出次生物质产量高的细胞株系, 可以采用比色法、HPLC、MS和放射免疫等方法来加以分析。以前的研究多偏重于提高次生代谢产物的含量, 现在已兼顾产物的含量和细胞的生长速度。采用目视和HPLC相结合的方法, 快速准确地筛选出高产藏红花素的细胞系种子。采用目视法可初步确定愈伤组织的生长快慢、易褐化情况及颜色,并快速筛选出生长较快、或不易褐化、或颜色为黄色的细胞系HPLC检测结果表明该筛选方法的可行性, 栀子愈伤组织的颜色和藏红花素的含量有一定关系, 如淡黄色的愈伤组织比白颜色的藏红花素含量高。在目视筛选法的基础上, 进一步通过再培养和HPLC检测可确定细胞系的藏红花素含量和生长情况, 筛选出藏红花素含量较高、生长快速并不易褐化的细胞系种子, 兼顾了次生代谢产物的含量和细胞的生长速度。因此本研究方法不仅对产藏红花素栀子愈伤组织的筛选具有应用前景, 对其它细胞系的筛选也有参考价值。 3. 种质资源的选择与保藏 高产细胞系的选择不仅要考虑产物的含量, 还要兼顾细胞的生长速度。藏红花球茎细胞系在添加0. 5mg /L 2, 4-D 和0. 25mg /L 6-BA的MS 固体培养基上, 25 /1e 全时暗培养20d, 藏红花素的含量为1. 721mg /g, 其干重达到4. 2g /L, 藏红花素产量为7. 14mg /L。栀子愈伤组织的藏红花素含量( 0. 348mg /g)不如藏红花愈伤组织的高, 仅为藏红花球茎1细胞系20%, 但筛选的栀子种子4细胞系生长比较快, 培养20d, 其干重达到5. 6g /L, 藏红花素产量达1. 94, 为藏红花球茎1细胞系的27%, 因此种子4 细胞系可作为进一步研究产藏红花素的种质资源。 4.目前的困境： .首先, 由于培养基缺陷或处理方法问题, 即使用4种不同培养基和3种不同处理方法来分离内生真菌, 也不能保证分离出所有藏红花的内生真菌.其次, 由于内生真菌长期生活在寄主植物内部, 其菌株的生理活动和代谢息息相关, 一旦从寄主植物中分离出来后, 自身的一些特性也会随之消失, 菌种容易出现退化现象.这些问题加大了内生真菌中次生代谢产物研究的难度.因此, 优化和改良培养条件或者在体外模拟宿主体内的生存环境, 这些方面都还值得深入研究 5.前景 植物内生真菌指的是生长在植物体的根、茎及叶等组织中的细胞间隙或细胞内,与植物建立无害的共生关系的一类真菌,是植物微生态系统中的天然组成成分内生真菌可以产生许多次生代谢产物在农业医学生物技术领域中有广泛的应用前景。从发现内生真菌到至今，药用植物内生真菌的研究已经开展了很多工作，也有许多的研究成果．但还有许多基础研究需要我们去做，如内生真菌对药用植物具体的作用如何，仍然无法测定：产生如此多的活性物质的机理也无法搞清楚机理，只是用少量的证据推测等等。但是药用植物内生真菌已经引起人们的普遍关注，越来越多的学者将会投入到药用植物内生真菌的研究中，药用植物内生真菌将会越来越被人们所认知。 参考文献 [ 1]国家药典委员会.中国药典一部[ S] .北京:化学工业出版社, 2005. [ 2] 凌学静, 张海石, 黄岩.西红花对小鼠免疫增加作用的研究[ J] .中国中医基础医学杂志, 1998, 4(12):28 -29. [ 3] 赵培, 罗春丽, 吴小候, 等.藏红花素对人膀胱移行细胞癌T24细胞裸鼠移植瘤的实验研究[ J] .中国组织化学与细胞化学志, 2008, 17(3):308 -312. [ 4] 周立刚, 郑光植.生产次生物质的植物细胞大量培养[ J] .生物工程进展, 1991, 11(1):29 -34. [ 5] 方中达.植病研究方法[ M] .北京:中国农业出版社, 1998. [ 6] 魏景超.真菌鉴定手册[ M] .上海:上海科学技术出版社, 1979. [ 7] 郁庆福.现代卫生微生物学[ M] .北京:人民卫生出版社, 1995. [ 8] 中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组.常见与常用真菌[ M] .北京:科学出版社, 1973. [ 9] 巴尼特HL, 亨特BB.半知菌属图解[ M] .沈崇尧译.北京:科学出版社, 1977. [ 10] 邵长伦, 谭倪, 杨瑞云, 等.南海红树林内生真菌ZSUH 36 次级代谢物的分离鉴定[ J] .应用化学, 2009, 26(1):7 -10. [ 11] 孙端方, 冉雪琴, 王嘉福.一株产紫杉醇罗汉松内生真菌的分离和鉴定[ J] .微生物学报, 2008, 48(5):589 -595. [ 12] 华辉, 郭勇.黄酮类化合物的药理研究进展[ J] .广东药学, 1999, 9(4):9 -12. [ 13] 李丽华, 陈锦屏.皂甙的提取纯化方法及其生物活性的研究进展[ J] .农产品加工, 2008, (1):60 -62. [ 14] 高蓬明.冬凌草内生真菌抗肿瘤活性菌株筛选[ J] .安徽农业科学, 2008, 36(29):12759 -12760. [ 15] MOLNARJ, SZABOD, PUSZTAIR, eta1.Membrane associated antitum or effects of crocine ginsenoside and cannabis noid derivates[J] .Anticancer Res, 2000, 20(2A):861 -867 [ 16] DAS，I CHAKRABARTYRN, DASS. Saffron can prevent chemically induced skin carc inogenesis in Swiss albino mice[ J] .AsianPacJCancerPrev, 2004, 5(1):70 -76. [17]ABDULLAEVFI,REVERO-NEGRETEL,CABALLERO-ORTEGAH, etal.Use of in vitro assays to assess the potential antigen toxic and cytotoxic effects of saffron(Crocus sativus L)[J] .Toxicology In Vitro, 2003, 17(5-6):731-736. |
