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引言
L-丙氨酸主要用于生化研究、组织培养、医学鉴定，食品添加剂等领域。工业上主要以L-天冬氨酸为原料，经脱羧、过滤、结晶干燥得成品。而天冬氨酸β-脱羧酶是该生产工艺的关键酶。本研究通过基因工程的手段构建高效表达体系，提高天冬氨酸脱羧酶的活性，改善工艺路线，节约生产成本。
1.1 L-天冬氨酸β-脱羧酶(L-aspartate-β-decarboxy-lase,EC4.1.1.12,Asd或ADL)是迄今为止自然界中发现的唯一氨基酸β-脱羧酶,它能催化L-Asp脱羧生成L(α)-丙氨酸。目前已用来生产L-Ala以及拆分DL-Asp生产D-Asp。自从Mardashev和Glad-kova(1948)首次报道在假分枝杆菌(Pseudomyco-bacterium)中存在该酶后,在许多微生物中,如德阿昆哈假单胞菌Pseudomonas dacunhae)、粪产碱菌(Alcaligenesfaecalis)、醋酸杆菌(Acetobactersp.)、无色杆菌(Achromobactersp.)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、脱硫脱硫弧菌(Desul-fovibrio desulfuricans)、小球诺卡氏菌(Nocardiagloberula)、桔青霉(Penicillium citrinum)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)中都发现此酶[1]。此外,在无脊椎动物如蚕、小龙虾、龙虾[3]及哺乳动物的大脑、肾脏、肝脏中也都大量存在酶[2]。Asd的辅因子是5′-磷酸吡哆醛,以还原型连接到酶上。
1.2 Asd酶学性质1.1.1 Asd的底物及反应常数Asd的底物专一性不强。例如A.faecalis中,除了L-Asp(Km值为0.68 mmol/L)外,Asd还能以半胱氨酸亚磺酸盐、氨基丙二酸、苏糖-β-羟天冬氨酸、β-氯-L-丙氨酸等为底物,相对应的Km值分别为4.8、3.0、0.089、0.063mmol/L[3]。笔者研究发现:Asd可引起L-谷氨酸、富马酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、水杨酸、菸酸、叶酸、维生素C、甲酸、乙酸、丙烯酸、氨基苯磺酸、顺丁烯二酸酐、邻苯二甲酸酐等多种有机酸及酸酐脱羧。
1.2.2 Asd的最适温度和最适pH值
Asd是一个多功能酶,发挥不同的催化活性需要不同的温度和pH值。Shibatani等[4]研究发现P.dacunhaeAsd表现脱羧及转氨作用的最适温度是47℃,脱硫作用的最适温度是30℃;转氨作用最适pH为1.5,脱硫作用最适pH为4.0,脱羧作用最适pH为5.3。
1.2.3 Asd的稳定性
El-Rahmany也研究了C.elegans和P.citri-num的Asd在不同条件下的稳定性[5]。结果显示:50℃下处理40min,C.elegans和P.citrinumAsd活性分别损失75%和85%;15℃下经过6d,两者Asd活性均损失52%,经过16d,Asd活性完全丧失;4℃下Asd酶活迅速丧失。Wilson等[6]发现:4℃、pH7.0条件下,Achro-mobacter sp.的Asd浓缩液很稳定,而稀溶液很快失
活。
1.2.4 Asd酶活抑制剂
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