- 背景介绍
CD137L又名4-1BB，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员9（TNFRSF9）。主要表达于活化的 T细胞和NK细胞。在体内，CD137L可与其受体CD137结合成为CD28的协同共刺激信号，维持CD4 T和CD8 T细胞活化状态。
pGEX4T-1载体是一种常用的原核表达载体，具有Amp抗性，质粒大小为4.9kb。该载体多克隆位点区域含有多个常用的内切酶位点序列，且全序列中含有tac启动子、GST标签序列，是一种高效的蛋白表达载体。可在大肠杆菌BL21、Rosstea等表达菌株中高表达融合有GST标签的蛋白，且用凝血酶可将目的蛋白的GST标签切掉，便于下游蛋白纯化。
- 实验内容
1、构建pGEX4T-1原核表达载体：
1.1引物的设计与合成
通过密码子优化的CD137L基因插入pGEX4T-1质粒中,用Primer Premier5.0软件设计特异性引物序列，并在序列中添加EcoR I和Xho I双酶切位点。
1.2目的基因的扩增及纯化
以含有目的基因的pGEX4T-1质粒为模板，扩增目的基因。用PCR扩增体系，按照94℃预变性, 58℃退火,72℃延伸扩增出目的条带。用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物, 凝胶成像系统观测并记录结果。在紫外灯下切下目的条带, 用胶回收试剂盒提纯目的DNA。
1.3连接与转化
PCR扩增并纯化后的目的基因片段和载体分别用EcoR I和Xho I37℃双酶切4h，酶切后的目的基因和载体分别经琼脂糖凝胶电泳后割胶纯化回收。将回收的目的基因与载体按一定比例混合，构建含有目的基因的重组质粒pGEX4T-1/CD137L，并转化宿主菌。
1.4重组质粒pGEX4T-1/CD137L的筛选与鉴定
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