1.文献综述
1.1研究背景
牡丹（Paeonia sect. Moutan）为多年生落叶亚灌木，我国是栽培牡丹起源和演化中心，有悠久的牡丹栽培历史。牡丹作为一种重要的观赏植物素以花型优美、瓣形多 变、色彩艳丽著称，深受人们的喜爱；牡丹除作观赏外，其花可直接食用、做花茶和糕点，也可酿酒和提取精油制作化妆品[1]；牡丹花、根和丹皮药用价值极大，在治疗肿瘤和动脉硬化、抗衰老、预防关节炎、降血脂方面具有重要作用[12]；牡丹还可以作为油料植物，2011年我国卫生部批准紫斑牡丹和凤丹籽油作为新资源食品，2014 年国务院首次以文件形式肯定油用牡丹的价值并加以支持推广。并且，牡丹籽油在降血脂、降胆固醇、抗衰老、抗癌等方面具有重要作用[2]。牡丹是集观赏、药用、食用及油用于一身的木本植物，经济效益极大，开发前景广阔。
1.2研究目的与意义
牡丹属于芍药科（Paeoniaceae）芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect.Moutan)，是中国传统名花、重要的药用植物和优质的油料作物，拥有较大的市场潜力。因此，牡丹的良种快繁是牡丹产业化推广面临的首要课题，而组织培养和扦插作为植物快繁主要手段，皆由于不定根发生困难而无法应用于牡丹产业化推广。从前期大量研究中推测牡丹试管苗不定根的发生受继代培养周期的影响，因此探究其二者关系。现以生长状况良好的牡丹“正午”组培苗为实验材料，增殖培养过程中定期切取单芽转入生根培养，分析继代周期影响试管苗不定根发生的生理机制、分子机制和DNA甲基化表观遗传调控机制，筛选获得最佳的继代培养周期，为牡丹试管苗生根技术的优化奠定基础，为揭示牡丹不定根发生机理提供重要的参考信息。
1.3研究进展
自开展牡丹微繁殖研究以来，在外植体类型和取材时期、培养基筛选和环境因子调控等方面均取得不同程度的进展，而其未能应用于规模化生产的主要原因在于试管苗生根难和移栽成活率低。其中，生根难主要表现, 一是生根率不高，不同品种生根率差异大，一些品种尚未获得生根苗;二是生根质量不高, 根从苗基部的愈伤组织产生, 使根与茎中间形成离层,影响了不定根与维管束之间的连续性，直接影响地上和地下器官的养分和水分的运输，阻碍植株对养分和水分的吸收，不利于生根[3]。同时，移栽后愈伤组织极易腐烂，从而导致植株死亡，导致移栽成活率低[13]。目前，关于牡丹试管苗生根机理的研究尚未见报道。因此，有必要研究牡丹试管苗的生根机理，探寻继代周期对牡丹试管苗的影响机理，进而解决牡丹试管苗生根难题。
1.3.1牡丹不定根发生的生理研究
（1）激素
在植物的不同发育阶段，不同种类的内源激素含量呈规律性的变化，其效应可决定植物个体发生的正常进行。目前关于牡丹不定根发生过程中内源激素的变化研究还很少。Zeng 等研究了牡丹生根时期内源激素生长素（IAA）、脱落酸（ABA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）及 IAA 与它们三种的比值对生根的影响。研究发现，IAA 与 ABA、GA、CTK 的比值在根原基形成初期增加， 在根原基生长期水平较低，在根生长期又恢复到原有水平[14]。贺丹也对牡丹试管苗不定根发生过程中内源激素的变化进行了细致研究，在第 3d 根原基诱导开始，IAA 含量明显升高，ABA 和 CTK 含量下降。在不定根突出表皮之前，IAA含量变化波动较大，ABA 含量有所回升；在不定根突出表皮之后，根伸长期 IAA含量变化趋势平缓；根伸长前期，ABA 含量降低，后期趋于稳定，生根基本结束后 ABA 含量大幅度回升。在根原基基本形成和伸长期，CTK 含量升高，根伸 长后期有所下降，生根基本结束后开始回升[4]。由此可见，牡丹多种内源激素参与调控其不定根的发生，内源激素中 IAA 及其与 ABA、GA、CTK 的比值对牡丹不定根的发生有重要影响。但不同牡丹品种间内源激素水平存在差异，不定根发生过程的内源激素变化仍有待深入研究。
（2）酶
牡丹不定根发生过程中，过氧化物酶（POD）、多酚氧化酶（PPO）、吲哚乙酸氧化酶（IAAO）对根的生长有很大的影响。
POD 活性与根原基形成密切相关，可起着调节根原基形成的作用[15]。生根诱导阶段，POD 活性变化对不定根发生有影响，碱性 POD 影响生长素的代谢诱 导生根，酸性 POD 影响木质部的发育和细胞壁的合成[16]。李航的研究表明，牡丹试管苗不定根发生过程中，POD 活性变化呈单峰曲线，POD 对生根率呈现显 著正相关[5]。贺丹的研究发现，试管苗转入生根培养基后的前 5 天 POD 活性变 化剧烈，第 1d 便达到峰值，第 2d 骤降后便呈波动式下降，23d 后逐渐较平稳[4]。前人研究表明，牡丹不定根发生过程中 POD 活性影响着根原基的诱导发生，根原基诱导开始产生，POD 活性降低有利于根原基的诱导。
PPO 是一种含铜的酶，可催化对不定根的起源和发育有密切关系的酚类物 质氧化[6]。李航的研究表明，牡丹试管苗不定根发生过程中，PPO 为双峰曲线，除常规培养条件下lsquo;胡红rsquo;的 PPO 活性峰值出现在第 15d 和第 30d 外，其他处 理的两次峰值出现时间大致在第5d和第20d，PPO与生根率的相关性不显著[5]。贺丹的研究发现，试管苗转入生根培养基后 PPO 活性开始下降，随后波动式上 升，至 38d 后稳定上升[4]。根原基的诱导开始后，PPO 活性先升高后下降；根基本形成后，PPO 活性开始上升；根的伸长期 PPO 活性升高，PPO 活性的升高有利于生根。此外，PPO 活性还与外植体褐化有密切关系，其作用于天然底物酚类 物质而形成醌，导致外植体的褐化，从而影响外植体的生根[7]。所以 PPO 也是牡丹试管苗易褐化的重要影响因素之一，因此 PPO 对牡丹不定根的发生有双重效应, 尤其在根伸长期，PPO 活性持续升高，有利于生根但同时又会引发褐化等问题。
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