文冠果（Xanthoceras sorbifolium）多态性SSR分子标记验证研究
1.文冠果概况及研究进展
文冠果( Xanthoceras sorbifolia)为无患子科文冠果属落叶灌木或小乔木，又称文官果、木瓜等。文冠果种子含油量超过30%，种仁含油量超过66%[1]，是我国特有的珍稀木本油料植物，可以用来制作高级食用油，也可作为提炼机械燃油、润滑油的原料。具有耐寒、耐寒、耐贫瘠等特点。原产于我国西北部，寿命可超过200年，具有很高的经济价值[2]。是国家重点开发的生物质能源树种之一[3]。文冠果的叶中含有大量类黄酮化合物[4]。类黄酮可以有效的去预防一些疾病，如癌症、心脏病、糖尿病等。氧化特性是其一大最主要的特性之一。目前，对文冠果的主要研究集中在育苗、种植、不用部位挥发油的提取、理化性质、成分分析等方面。文冠果适应范围广，具有很强的抗逆性。正因为其抗逆性强，所以文冠果在我国我分布很广。在我国，东起山东，西至新疆、西藏，南起江苏、河南，北至黑龙江省都有种植。并且由于文冠果开花时间较晚，可以尽量避开晚霜的危害[5]。但是目前文冠果的栽培仍然有一系列问题有待解决，其中最主要的问题便是文冠果移栽的成活率低，而且还有文冠果结果率低等[6]。这些问题很大程度上制约了文冠果产业的发展。因此，从文冠果遗传方向去进行改良是一个很好的进行科研的角度。目前国内对文冠果分子标记的研究较少，从分子标记角度研究或许可以一定程度上了解到文冠果移栽成活与结果率低的问题。因此，开发文冠果分子标记技术在为文冠果种质资源利用、保护和文冠果生产实践上有极大意义。
2.转录组测序概述
转录组测序（RNA-seq）是利用高通量测序技术检测信使 RNA（messengerRNA，mRNA）、小 RNA（small RNA）及非编码 RNA（non-coding RNA）的序列的测序分析技术[7]，反映其表达水平。RNA-seq因其通量高、灵敏度高、分辨率高及不受物种限制等优点，被认为是一种在转录水平上更为精确的测定分析方法，该技术已经在动植物等研究领域开展了广泛的应用[8]。转录组测序是一种获得生物组织或细胞几乎所有转录本中的高通量测序技术，测序所得的基因编码序列可用于研究植物在不用条件下的基因表达、调控方式及后续的功能基因发掘与遗传进化分析。转录组测序技术在动植物种上开展未知基因挖掘、分子遗传标记开发、代谢途径分析、遗传机制分析等研究上应用广泛[9]。随着分子标记技术的开发与成熟，转录组测序数据可以作为标记开发的重要来源，为文冠果展开种质资源多样性评价、遗传变异分析、居群结构研究和育种提供了有效的工具。通过转录组测序，研究者已经开发出大量的 SSR（简单重复序列）和 SNP（单核苷酸多态性）应用于分子标记。可以应用SSR分布特点和种类，利用MISA软件分析转录组数据，来区分文冠果种质资源[10]。同时，分子标记辅助选择是分子育种学科的重要组成部分，EST-SSR标记目前在亲缘关系鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析等方面发挥了巨大的作用[11]。
3.SSR分子标记概念及应用
DNA分子标记是鉴定与评价种质资源遗传多样性的重要手段之一。主要包括主要涉及随机扩增多态性 DNA (RAPD)、 扩增片段长度多态性(AFLP))、 简单重复序列间扩增(ISSR)、目标起始密码子多态性(SCoT)、表达序列标签-简单重复序列(EST-SSR)和简单重复序列(SSR)标记。SSR（Simple Sequence Repeats）简单重复序列，又称微卫星 DNA 或短串联重复标记， 以1-6 个核苷酸为重复单位组成的串联重复序列广泛分布于基因组的不同位置， 是一种以 PCR 技术为核心的 DNA 分子标记技术[12]。 微卫星是由 DNA复制或修复过程中滑动和错配或者有丝分裂、减数分裂期姐妹染色单体不均等交换而引起的。SSR 在物种的不同位点或同一位点的不同位基因间存在非常丰富的差异，具有很高的突变频率。这就是为什么会出现很多的重复序列的重要原因之一。但是每个 SSR 序列的两端大多是保守的单拷贝序列，根据序列的两端可设计出一对互补的特异性引物，通过 PCR 技术扩增出来，扩增片段通过电泳分析技术获得其长度的多态性[13]。SSR 作为第二代分子标记技术，有着以下几方面的优点：(1)符合孟德尔遗传定律，共显性，不易被自然选择和人工选择所淘汰；（2）在基因组中数量丰富，多态性高；（3）仅需少量 DNA即可进行 PCR 扩增，不会出现原材料不足而实验无法进行下去的情况，其产物通过电泳分析，操作简单，PCR 扩增的可重复性高；（4） 在不同物种间有良好的通用性。SSR 标记主要可以分为基因组 SSR（gSSR）和表达序列标签 SSR（EST-SSR）两种，基因组 SSR（gSSR）是通过 cDNA文库构建与克隆测序的方法获得的，但是步骤较为复杂，工作量大且花费较大；表达序列标签 SSR（EST-SSR）则是通过在公共数据库搜索表达序列标签和转录组测序的结果来开发，具有较高的通用性，成本较低且信息量大[14]。
其中，SSR 标记是由1~6 bp 核苷酸组成的 DNA 片段，在真核生物基因组广泛分布，平均约每10 kb核苷酸就会出现一个SSR序列，且两端有高度保守序列。由于不同物种的 SSR 序列及重复次数不同，使 SSR 标记在不同物种表现出高度的保守性和重复性，从而可以对不同物种进行准确鉴定。微卫星分子标记 (Simple Sequence Repeats, SSR) 具有重复性好、多态性高、表达为共显性、标记数量多等优点，已经被广泛应用于种质资源鉴定[15]、遗传图谱构建以及遗传多样性分析等领域[16]。目前，已有多种树木开发出了新的SSR分子标记技术。刘丹（2019）开发了闽楠SSR和EST-SSR分子标记用来对闽楠的6个不同种源的野生群体进行遗传多样性分析，探究其地理变异模式[17]。李庆国等（2018）利用 SSR 分子标记技术对我国不同纬度地区的白蜡种质资源进行指纹图谱构建[18]。目前，已有利用SSR分子标记方法，来对全国部分地区包括天然林在内的文冠果进行不同居群的遗传多样性和亲缘关系进行分析[19],但是对种质资源少有研究，因此本实验对文冠果SSR分子标记的开发进行相关的探究及分析。
4.研究目的与意义
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