1.引言
喜树（Camptotheca acuminate）又称旱莲、水桐树、千丈树，蓝果树科（Nyssaceae）喜树属（Camptotheca）多年生落叶乔木，是我国所特有的一种速生丰产的优良树种。喜树中富含喜树碱，喜树的果实、根、树皮、树枝、叶均具有很高的药用价值。喜树碱是从喜树中分离出来的一种天然萜类吲哚生物碱 （TIAs），具有独特的抗癌效果，是目前为止发现的唯一一种特异性通过抑制拓扑异构酶Ｉ来发挥细胞毒性作用的天然植物活性成分[1]。喜树碱类的衍生物如喜树碱、10-羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康，主要用于治疗结肠癌、小细胞肺癌和卵巢癌等[2]。谢慧敏基于6对ISSR标记开展了喜树种质资源的分子评价，发现我国的喜树种质资源存在着较高的遗传多样性[3]。近几年，由于生态环境恶化和对喜树资源过度开发，加速了现有喜树种质资源的减少与退化。但是，目前研究学者对喜树分子标记的研究较少，也在一定程度上限制了对喜树遗传多样性的研究。因此，开发喜树的分子标记技术可以为喜树种质资源的利用、保护和分子育种奠定基础。
DNA分子标记是鉴定与评价种质资源遗传多样性的重要手段之一，其中微卫星分子标记 (Simple Sequence Repeats, SSR) 具有重复性好、多态性高、表达为共显性、标记数量多等优点，已经被广泛应用于种质资源鉴定[4]、遗传图谱构建以及遗传多样性分析等领域[5]。SSR标记主要可以分为基因组SSR（gSSR）和表达序列标签SSR（EST-SSR）两种[6]。EST-SSR来自于DNA序列的转录区域，具有较高的通用性，与构建文库进行筛选建立gSSR相比，从EST序列开发SSR引物更加经济，同时省去了传统方法开发过程中的克隆和测序步骤，节省了大量的资源[7]。目前，多种植物已经应用EST数据开发出了新的SSR分子标记技术，如杨树、桉树、银杏等多种木本植物中均有相关研究报道[8-10]。
本研究拟基于喜树转录组高通量测序数据，对转录组所获得的Unigene的功能进行GO分类和KEGG代谢通路分析，分析其分布组成及特征，并开发SSR引物，建立喜树EST-SSR分子标记技术，以期为喜树种质资源分子鉴定，遗传多样性分子评价和分子标记辅助育种奠定基础。
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- 喜树研究进展
喜树是落叶乔木，树高20余米，树皮灰色或浅灰色，纵裂成浅沟状。小枝圆柱形，一年生枝紫绿色，有灰色绒毛，多年生枝淡褐色或浅灰色，无毛。喜树叶片叶全缘互生，纸质，矩圆状卵形或矩圆状椭圆形，长12-28厘米，宽6-12厘米；常由2-9个头状花序组成圆锥花序，顶生或腋生总花梗圆柱形。花杂性同株；花萼杯状；花瓣5枚，淡绿色，矩圆形或矩圆状卵形；子房下位，花柱无毛，顶端通常分2枝。矩圆形翅果，顶端具宿存的花盘，两侧有窄翅，着生成近球形的头状果序。喜树花期一般为5-7月，果期通常为9月。喜树是深根性树种，喜光，不耐严寒干燥。较耐水湿，在酸性、中性、微碱性土壤均能生长，在石灰岩风化土及冲积土生长良好。
喜树由于富含能够治疗癌症的药用成分—喜树碱(Camptothecin，CPT)，逐渐受到人们广泛关注。喜树碱(Camptothecin，CPT)是Wall等在1966年从喜树中分离获得了一种萜烯类生物碱[11]，据临床试验结果表明，喜树碱通过抑制肿瘤细胞内拓扑异构酶I 的活性而具独特的抗癌效应，DNA拓扑异构酶(Topo I)是在细胞增殖过程中的关键酶，喜树碱通过结合Topo I和DNA复合物，构成一个稳定的三元复合物，来阻止了DNA自身的再次连接，破坏了细胞周期，从而引起癌细胞的死亡[12]。根据目前的研究结果表明，羟基喜树碱通过联合用药可减小毒副作用并且降低单一用药产生的耐药性，提高抗肿瘤效果[13]。杨春旭等发现奥沙利铂联合羟基喜树碱对治疗晚期胃癌具有明显的效用，且患者产生的不良反应较轻[14]。高向阳等利用羟基喜树碱并用5－氟尿嘧啶在晚期大肠癌患者的临床治疗中取得了显著的疗效，为大肠癌的治疗提供了依据[15]。 此外，喜树碱类的衍生物如10-羟基喜树碱、伊立替康和拓扑替康，也广泛用于治疗结肠癌、小细胞肺癌和卵巢癌等[8]
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- 转录组测序概述
1.2.1转录组测序简介
转录组测序（RNA-seq）是利用高通量测序技术检测信使RNA（messenger RNA，mRNA）、小RNA（small RNA）及非编码 RNA（non-coding RNA）的序列的测序分析技术[16]，反映其表达水平。RNA-seq因其通量高、灵敏度高、分辨率高及不受物种限制等优点，被认为是一种在转录水平上更为精确的测定分析方法，该技术已经在动植物等研究领域开展了广泛的应用[17]。目前应用最广泛的是二代测序中Illumina的NGS测序平台。这种方法需要根据实验目的对RNA样本进行处理，将mRNA，miRNA，lncRNA 其中的部分或全部反转录成cDNA文库，再利用高通量测序平台进行测序[18]。Illumina的边合成边测序（Sequencing by synthesis，SBS）技术近几年发展迅速，此种方法是将提取的核酸片段打断到几百bp后，加上接头引物和测序引物等序列，利用PCR扩增后建成library，在含有接头序列的芯片（Flow cell）上对文库进行反应，在每个反应循环中，对4种碱基标上荧光染料并通过互补碱基配对加入到单分子的合成中，这样通过CCD采集序列上的荧光信号即可读取测序片段的碱基序列[19]。
1.2.2 转录组测序的应用
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