- 樟疫霉的相关研究进展
疫霉属（Phytophthora）属于卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Peronosporales)、腐霉科（Peronosporaceae），是一类重要的植物病原菌，对许多种植物造成重大的破坏性影响[1,2]。疫霉属中存在多种重要的植物病原菌，如致病疫霉（P.infestans）在十九世纪中叶导致的马铃薯晚疫病引起了爱尔兰大饥荒，超过一百万人死于饥饿，至今仍是一个严重的世界性问题；辣椒疫霉（P.capsici）可侵染多种重要的蔬菜，如辣椒，番茄，茄子和利马豆[3]；大豆疫霉每年给大豆产业造成数百万美元的损失[4]等。樟疫霉（P.cinnamomi）是林业上的一种重要病原菌，不同于大豆疫霉等的寄主单一，樟疫霉可侵染五千多种植物，包括许多在农、林业中的有重要意义的植物，如鳄梨，栗子，橡树，杜鹃等[5]，造成严重的经济损失，还可以对生态系统和生物多样性造成灾难性的后果。据估计，在加利福尼亚州，樟疫霉每年给鳄梨作物造成的经济损失超过4000万美元。
尽管疫霉菌在形态和生理上与丝状真菌很相似，分子分析显示，真菌和卵菌的谱系在真菌从植物和动物中分离出来之前就已经分化[6]，卵菌的分类地位更接近于藻类，属于假菌界[7]。许多用于控制真菌病害的化学药剂对疫霉引起的病害不能起到明显的抑制作用，因此深入了解樟疫霉的致病过程和侵染机理是针对性的制定其引起的病害防控策略的重要基础。近年来，二代测序技术产生的疫霉基因组数据的释放，如大豆疫霉，致病疫霉，樟疫霉等数据，极大的促进了对其致病机理的研究[8,9]。然而，由于缺乏有效的基因工程策略，卵菌的功能基因组学研究一直受到阻碍。CRISPR/Cas9是一种定点基因编辑技术[10,11],其成本低，高效且易于操作，目前已被广泛应用于不同种动植物以及微生物的基因编辑中，2016年，Fang等[12]首次将该技术应用于卵菌中，成功敲除了大豆疫霉的Avr4/6基因，随后该技术被成功地应用到了辣椒疫霉（P.capsici）和棕榈疫霉（P.palmivora）中[13,14]。
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- 疫霉与植物间的互作
樟疫霉是半活体营养型真菌，在侵染寄主的初期营活体营养，后期转为死体营养[15]。研究表明许多基因在这两个不同的阶段特异性表达以支持其半活体营养生活方式及帮助其侵染定殖。尽管缺乏可移动的防御细胞和适应性免疫系统，植物在与病原菌的长期互作中进化出了独特的防御策略。这些防御策略可以分为两种类型：一种是跨膜模式受体识别（PRR），它可以识别微生物或与病原体相关的分子模式（MAMPs或PAMPs），称为PAMP诱发的免疫(PAMPs triggered immunity,即PTI)，可以有效地防御大部分病原体的感染。为了对抗植物防御，一些成功的病原体会分泌特殊的效应子来抑制或干扰PTI帮助自己定殖。当植物细胞识别一种效应子时，另一种策略即效应子触发免疫(effector-triggering immunity,即ETI)正在激活。在自然选择的压力下，病原体正在将已确定的效应子基因多样化或获得更多效应子以避免ETI[16]。这种动态消长的病原菌与植物之间的对抗与共同进化被称作“zigzag”模型。（图1-1）。
图 1-1植物免疫系统的“zigzag”模型（Jonesamp;Dangl,2006）
2疫霉转化体系最新进展
CRISPR/Cas系统是存在于多数细菌和绝大多数古菌中的一种后天免疫系统，以消灭外来质粒或者噬菌体，并在自身基因组留下外来基因片段作为“记忆”以便于下次对其消灭。目前已发现多种不同类型的CRISPR/Cas系统，其中CRISPR/Cas9较简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成成分，利用gRNA识别靶标位点，并引导具有核酸内切酶活性的Cas9蛋白定向切割靶标序列[17,18]。经研究人员改造，CRISPR/Cas9系统已成为一个有效的基因编辑系统，gRNA引导Cas9蛋白切割靶标序列产生双链断裂(DNA double-strand breaks, DSBs),此后活细胞内的DNA修复机制会对受损的DNA链进行修复。DNA修复主要有两种方式：非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组修复(Homology directed repair, HDR)，NHEJ指不依赖于DNA同源片段而直接将DNA断裂端连在一起的修复过程，此过程中很容易发生碱基的随机插入或丢失，造成突变从而实现基因失活或目的基因突变。
CRISPR/Cas9系统为在许多生物体中产生靶向突变提供了宝贵的工具，已应用于多种动植物以及微生物中，2016年,Fang等将该技术首次应用于大豆疫霉中，成功的获得了敲除Avr4/6基因的大豆疫霉突变体，敲除效率高达8%[12]。该转化系统基于CRISPR/Cas9基因编辑技术，经PEG介导原生质体的转化，包括gRNA的设计，gRNA脱靶分析，准备CRISPR/Cas9质粒，sgRNA寡核苷酸退火，质粒与退火引物连接，转化连接产物，PEG介导的原生质体转化与转化子的筛选与验证等一系列步骤。该方法已成功应用于多种疫霉中，在应用于荔枝疫霉中时敲除效率高达8.6%[19]。CRISPR/Cas9系统在真菌中的敲除效率普遍能达到70%以上[20-23]，但在卵菌中的敲除效率则较低，可能是由于卵菌是双倍体，需要同时将等位基因编辑等，同时不同基因之间的敲除效率也有较大的差异[19]，具体差异则需要进一步的研究。
3 植物病原卵菌效应分子的研究进展
在与植物的互作过程中，疫霉菌分泌大量的效应蛋白来调控植物的生长发育，干扰甚至控制植物的防御系统以及免疫反应以利于自身的侵染。根据效应子在植物体内作用位置的不同将其分为两类：一类是质外体效应子（Apoplastic effectors），分泌到细胞外空间与细胞外靶标和细胞表面受体相互作用，包括酶抑制子、坏死和乙烯诱导蛋白1-like（Necrosis and ethylene-inducing peptide 1-like protein，NLP）家族、SCR（Small cysteine-rich）家族和细胞壁降解酶（Cell wall-degrading enzymes，CWDE）等；另一类是胞内效应子（Cytoplasmic effectors），可能通过吸器等结构转移到植物细胞内起作用，主要包括RxLRs（R:精氨酸；x:任意氨基酸；L:亮氨酸）和CRNs（Crinklers）[24,25]。(图2-1)。
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