吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007生物膜相关基因克隆与表达分析
1.立题依据
细菌生物膜（bacterial biofilm, BF）是指细菌为了适应生存环境，黏附于有生命或无生命物体表面后，被细菌胞外自身产生的多聚物基质包裹生物有组织的细菌群体[1]。细菌生物膜是一个有组织而且具有明显三维结构的生命群体[2]，通常为复杂菌落，它的形成为一个动态发生的过程，主要包括三个阶段：定植期、成熟期和播散期。这种状态下的细菌与游离细菌相比，抗逆性更强，为细菌栖息的最佳状态[3]，具有良好的外界环境感知能力以及快速摄取营养的优点。具统计，自然界中大部分的细菌都是以生物膜形式而存在[4]。生物膜内的细菌可以表现出群体效应，植物病原菌的致病机制受这种群体行为的调控[5]。有证据表明，生物膜是细菌可持续发展及传播的一个重要步骤，包括中间基因的交换及相互间的协同作用[6]。1995年Costerton 在文章中首次提出了生物膜的概念[7]，在之后关于植物细菌的研究过程中，研究人员发现生物膜对细菌的定殖尤为重要，此后成为相关领域的研究热点[8]。洋葱伯克氏菌群(burkholderia cepacia complex，Bcc)的许多菌株是常见的生防菌[9]，可防治多种植物病原真菌病害，国内也有利用Bcc防治土传病害的报道[10]，而吡咯伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pyrrocinia)JK-SH007是杨树的一株高效革兰氏阴性生防菌，隶属于洋葱伯克霍尔德氏菌群基因型Ⅸ[11]。通过采用BCESM和cblA毒力基因特异性PCR，洋葱(Allium cepa)、烟草(Nicotiana sp.)及苜蓿(Medicago sp.) 模型等Bcc常用安全性检测技术对其毒性进行了初步检测，表明JK-SH007是一株有潜力的安全生防菌株。
杨树是中国一种重要的抗旱树种，如今，作为重要的防护林建设树种，杨树已在江苏省内大面积推广，但由于品种单一，栽植密度大，面积广，使得杨树溃疡病广泛发生。杨树溃疡病是杨树枝干部的重要病害之一，其发展速度快，分布面积广，在杨树幼林上危害较重[12]。近年来，杨树溃疡病的大面积发生，严重威胁我国杨树产业的健康发展[13, 14]。生物防治可以有效控制杨树溃疡病的发生。在野外的防治实验中，证实了JK-SH007的发酵液对于杨树溃疡病有一定的防治效果[15]，不仅能够起防治病害促进寄主植物的生长，还能提高杨树抗性，具有长期性、稳定性等优点，且在安全性评估中证明了它的潜力。在实际生产中，由于环境的复杂性，且JK-SH007的自然生活史大部分是浮游状态，它的生防效果会随时间迅速下降，生物膜的形成完美的应对了这些问题为了能够创建一个发酵体系激活其生物膜状态，我们需要使用分子生物学手段来了解生物膜的形成机理。
2.文献综述
2.1吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007的国内外研究进展
洋葱伯克氏菌群是一组基因型不同、表型相近的复合物（Burkholderia cepacia complex, Bcc），其中许多菌株是常见的生防菌，不但用于植物病害防治和促进农作物的生长，而且也被用于环境保护、生物修复、降解土壤中的有毒物质等[16-19]。Bcc的九种基因型中，只有基因型Ⅸ(B.pyrrocinia)是唯一只在野外分布的基因型，该基因型未在医院和病人身上分离到。研究还表明，B. cepacia的一些基因型具有防治植物病害和促进植物生长的作用。作为生防菌，Bcc被制成生物杀虫剂和生物杀菌剂，能代替部分农业生产中常用的化学农药，它在农业生产和环境保护方面起着重要的作用。目前有不少国家在生产和使用以Bcc为原料制成的生物农药。但以Bcc为材料来防治杨树溃疡病未见报道[20]。
高效防治杨树溃疡病的吡咯伯克霍尔德氏菌( Burkholderia pyrrocinia) JK-SH007,是一种从杨树干部筛选获得的对杨树溃疡病菌具有拮抗作用且具有内生性的生防细菌菌株。吡咯伯克霍尔德氏菌JK-SH007菌株是任嘉红等[21]筛选出来的，隶属于Bcc基因型Ⅸ，该菌株基因的平均GC含量高达65.71%以上[22]。拮抗细菌JK-SH007的代谢产物对杨树溃疡病的3种病原真菌拟茎点霉（P. macrospore）、金黄壳囊孢(C. chrysosperma)和七叶树壳梭孢(F. aesculi)有较好的抑菌作用，并预示着良好的应用前景[15]。菌株JK-SH007能够产生具有体外抑制这三种真菌生长的抗菌蛋白，该蛋白对热、蛋白酶K不敏感，碱性环境不利于其活性的发挥。另外，分离得到的抗菌蛋白可以通过基因工程技术改造杨树对溃疡病的抗病性。因此纯化JK-SH007菌株的抗菌蛋白，分析其氨基酸组成及部分序列克隆其基因，用于植物基因工程技术培育杨树抗溃疡病新品种或者构建高效表达抗菌蛋白的工程菌进行生物农药的开发，这具有重要的研究价值和应用前景[23]。
2.2细菌生物膜的相关研究
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