文献综述
- 苏云金芽孢杆菌
苏云金杆菌，又称苏云金芽孢杆菌，简称Bt，是蜡状芽胞杆菌群中一种需氧的，包括许多变种的一类可产生芽孢的革兰氏阳性细菌。苏云金芽孢杆菌成熟后，在其细胞的一端产生芽孢；另一端形成一个、两个或多个不同形态的伴孢晶体，即delta;-内毒素[1]苏云金芽孢杆菌因为其伴孢晶体的杀虫毒性而被广泛运用于生物农药领域。
delta;-内毒素是Bt生物农药杀虫的主要作用成分。delta;-内毒素本身无毒性，当晶体被昆虫摄食进入中肠后，晶体被碱性的中肠液溶解为前毒素，再经中肠的胰蛋白酶水解成对昆虫有毒力作用的多肽片段——毒蛋白。毒蛋白需要穿过中肠表面覆盖的的围食膜，才能与中肠上皮细胞刷状缘膜的特异性受体高亲和性地结合，从而引起一系列的作用，最终导致细胞膨胀解体，昆虫无法进食而死[2]。
围食膜是无脊椎动物所特有的一种半透性膜状结构，是昆虫用来防御毒蛋白的一道天然屏障，主要由几丁质和蛋白质构成。如果不破坏围食膜的结构，delta;-内毒素就无法作用于昆虫的中肠上皮细胞。几丁质酶可以通过降解昆虫围食膜的结构来增效Bt的杀虫作用[3]。同时，几丁质酶对于破坏组成昆虫外壳的几丁质以及抵御植物病原真菌都能起到一定的作用。张娜等人在2012年的研究中发现，Bt419-1对供试的10种植物治病真菌中的花生褐斑菌、苹果纹轮病菌、油菜菌核菌、黄瓜灰霉、水稻纹枯6种真菌的抑菌率达到80%左右[4]。因此，Bt生产几丁质酶的效应具有较大的研究价值。
人们对于苏云金芽孢杆菌内毒素的杀虫作用已经有超过了100年的研究历史，而对苏云金芽孢杆菌产几丁质酶效应的研究则起步较晚。1998年,英国学者率先用两菌株所产生的几丁质酶对蚊幼和海灰翅夜蛾的杀虫增效作用分别进行了研究[5]。并证实了几丁质酶在Bt生物农药中的增效作用。2003年，Aorra等在大肠杆菌中克隆了HD-l的几丁质酶基因,发现表达的几丁质酶能够增效Bt的营养期杀虫蛋白对斜纹夜蛾幼虫的毒力[6]。21世纪初，对于Bt几丁质酶的研究开始转入对蛋白质基因的筛选以及定位等方面的研究[7]。2010年开始至今对Bt几丁质酶的研究都集中在克隆、诱导表达、表达调控、基因转接等方面[8-9]。
二、苏云金芽孢杆菌产几丁质酶活性的研究进展
并不是所有的苏云金芽孢杆菌都体现出产几丁质酶的活性，因此首先需要筛选产几丁质酶的Bt菌株。筛选产几丁质酶菌株最常用的方法是制备以胶体几丁质为唯一碳源的琼脂平板，通过观察水解圈的有无及大小，初步确定菌株分解几丁质的能力。
同一种苏云金芽孢杆菌产几丁质酶的能力大小在碳氮源类型条件不同时呈现出较大的差异。2011年沙莉等人在选择不同添加物对苏云金芽孢杆菌产几丁质酶影响的研究中发现，当以非几丁质或几丁质水解物的碳源为唯一碳源时，几丁质酶的产量很低或几乎没有。同时，几丁质酶常被认为是诱导酶，因此在检验Bt产几丁质酶活性时，需要以培养基中具有几丁质或者几丁质水解物作为诱导物为前提进行研究。在此研究中还提到，在碳源和其他环境条件相同的情况下下，氮源对Bt产几丁质酶的影响体现在了产酶活性峰值和产酶量上，几丁质酶在LB培养基和牛肉膏蛋白胨培养基上体现了相同的产酶活力峰值时间，而LB培养基相比牛肉膏蛋白胨呈现出了更高的酶活性[10];而在相同的条件下加入不同的氨基酸时，酶的活力也体现出了显著的差异。在添加谷氨酰胺、天门冬酰胺时，Bt培养基在120h时达到最高的几丁质酶活力。而添加脯氨酸和甲硫氨酸的培养基最高产酶活力提前到了96h[11]，整体而言，氨基酸降低了Bt的产酶活性。因此在验证Bt菌株产酶活力时，选择正确的添加物质能够提高整个实验的效率。
实验室内Bt产出的几丁质酶，在不同的pH、温度等条件下体现出不同的作用活性。Bt几丁质酶作用的最适pH偏中性，在pH4.0-9.0都表现有不同程度的活性，与大多数细菌几丁质酶最适pH在3.0-11.0之间相符。由于昆虫中肠的碱性环境，相比酸性和中性，在碱性条件下具有更高活性的几丁质酶对杀虫增效作用可能更为明显。
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