松材线虫纤维素酶基因的克隆与表达模式研究
文献综述
1.1 研究背景
松材线虫病的病原为滑刃科（Aphelenchoididae）伞滑刃属（Bursaphelenchus）的松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus），能够引起松树上的一种毁灭性病害，短期内可致松树死亡，又称松树萎蔫病[1]。该病作为林业中最具危险性的病害之一，一直因其致病的复杂性和严重性而受到广泛关注。经研究统计，已有高达 50 多种松属树种和 10 多种非松属树种成为该病害的为害对象[2]。该病害自从1905爆发于日本长崎之后，目前已于亚洲、欧洲和北美洲等地的多个国家被发现和报道[3]。在中国，据国家林业和草原局2020年发布的公告显示，我国有18个省（区、市）666个县级行政区发生松材线虫病，发生面积达65万hm2。虽然对于该病病原研究早有了大量相关报道，但具体致病机理的明确描述尚未完全达成共识。为了进一步了解松材线虫，Kikuchi[4]在2011年发表了松材线虫的全基因组。自基因组组装公布以来，高通量测序技术频繁被用来鉴定松材线虫的致病性状。这些聚焦于基因、非编码RNA和基因组水平突变的工作扩展了我们对其分子发病机制的了解。但是相比之下，很少有关于松材线虫多拷贝基因的研究。而糖苷水解酶45（GH45）基因为松材线虫所特有，且已被证实是通过水平基因转移获得的，与其侵入过程中降解植物的细胞壁有关[5,6]。相关研究中通常认为GH45基因是单拷贝的，并不知道其可能存在拷贝数差异。因此，开展对GH45基因拷贝数和表达模式的研究将有助于阐明松材线虫致病机理。
1.2 松材线虫病致病机理
1.2.1 酶学说
松材线虫体内各种水解酶是导致松树萎蔫病早期症状的原因之一，Odani等通过体外实验证明纤维素酶和果胶酶等水解酶能让赤松产生与松材线虫侵染后相同的症状。其作用机理主要降解寄主的细胞膜和细胞壁，造成树脂道内树脂的外渗和相邻管胞水势升高，影响水分的正常运输，从而导致树体萎蔫[6]。Kikuchi等发现编码此类蛋白的基因主要来自于真菌和细菌的水平基因转移[5]。尽管此类水解酶在线虫和寄主互作机制中起重要作用，但在很多不致病线虫体内也发现了此类水解酶，因此水解酶与致病的关系还需要进一步研究。
1.2.2 分泌蛋白和外壳蛋白的作用
一方面，寄生蛋白研究主要集中在根结线虫和胞囊线虫等线虫，松材线虫也有较少报道。Shinya[7]等分析和鉴定出了1515个松材线虫的分泌蛋白，主要承担营养物质摄取、寄主体内迁移扩散和躲避寄主防御系统等功能。Espad[8]等通过比较松材线虫幼虫期和成虫期的转录组学数据，根据效应蛋白预测工具鉴定出较多的寄生相关基因，后续研究发现在线虫的成功侵染中扮演重要角色的蛋白可大致分类两类，分别于食道腺细胞和消化系统中特异表达，在侵染过程中发挥作用。
另一方面，线虫体表携带有的多种蛋白也被认为在致病过程中发挥着重要的作用，且作用方式较为直接。主要研究方法是通过凝集素结合实验和蛋白组学手段进行分析。Shinya[9]等发现在线虫的不同发育阶段，其糖蛋白的表达有明显的差异。还有相关研究发现松苗上提取线虫和实验室内用线虫食用菌培养的松材线虫的表面外壳蛋白存在明显差异，其中有17种蛋白在侵染后出现明显上调，进一步的研究发现此类上调蛋白可能参与响应寄主的防御反应。上述研究表明，松材线虫体表蛋白数量与种类因线虫生长发育和活动而变化，据此可推测其在线虫与环境和寄主间的互作中有着重要作用[10]。
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