银杏叶片转录组测序与SSR分子标记开发
- 银杏树种简介
银杏（Ginkgo biloba Linn.）为银杏科、银杏属落叶乔木，枝干长短不一，叶子在种子植物中是特别的，在裸子植物中是惟一的一种阔叶乔木，叶扇形呈二分裂或者全缘，成年银杏的扇状叶与幼株在全缘与分裂上也有所差异，叶脉与叶片平行而且没有中脉和长柄，它们在长枝上呈螺旋状排列，在短枝上簇生，雌雄异株，雌株夹角大，树冠宽大，胚珠长在珠座上。银杏栽培品种分为长子、佛手、马铃、梅核和圆子五大类，长子类品种有金坠子、橄榄果、粗佛子、圆枣佛手、金果佛手、叶籽银杏等品种，佛指类有佛指、洞庭佛手、贵州长白果、长糯白果等，马玲类品种有海洋皇、马铃、白果、圆底果、圆锥佛手、李子果等，梅核类品种有梅核、棉花果、珍珠子、眼珠子、庐山银杏等。银杏的寿命长，可以活几千年，在植物界它被称为lsquo;活化石rsquo;，从历史分布上看，银杏最早出现在3亿年前的（石炭纪）和（侏罗纪），曾分布在地球的亚、欧地区，并开始衰落（白垩纪）。在接下来的50万年前，由于地球上的冰川运动，地球的大部分开始冷却，植物开始灭绝，只有亚洲的银杏才能被保存下来，因此许多科学家把银杏视为植物界的“大熊猫”，甚至是植物界的“活化石”。水平分布而言，银杏叶有最长的东西分布距离30°N线和垂直变化纬度，银杏叶的东西向分布距离逐渐短，纬度越高，银杏叶的分布趋向于东部沿海地区，反之则趋向于西南部的高原山区。从垂直分布上来看，由于所在的地区纬度，地貌不同，分布的海拔高度就不完全一样。总的来说，银杏的垂直分布跨度比较大，从海拔几米、几十米到几公里不等。我国银杏资源主要分布在山东、浙江、安徽、福建等省，中国有六处“银杏之乡”分别是：湖北省安陆市、江苏省泰兴市、江苏省邳州市、山东省郯城县、广东省南雄市、浙江省长兴县。银杏是中国著名的观秋色叶树种，也是我国的珍贵物种，具有适应性强，耐旱，抗风抗火，对有毒气体有一定抵抗能力的特性。银杏喜深壤土，水分适宜，排水良好，在酸性土壤（pH4.5）和石灰性土壤（pH8.0）中生长良好，中性或微酸性土壤最适宜，耐旱性较好。银杏果实，俗称白果，具有医疗保健的功效。银杏叶和果实是我国重要的出口产品，特别是用于防治高血压和心脏病的医药原料。叶是银杏的主要药用成分，由于这些成分的存在，银杏备受重视，而叶中含有黄酮类化合物，苯酚类化合物，萜内脂等主要成分，还含有聚乙戊烯醇，以及微量元素，其中黄酮类化合物能提高机体免疫力，改善脑功能，促进血液流通，降低血液黏度、降低血脂，抗炎、抗肿瘤，清除自由基的活性等作用；酚酸类化合物具有抗肿瘤作用、抑霉作用、抑制炎症反应作用、抑制病毒作用等；银杏多糖具有降血压、抗衰老等生物活性；萜内脂化合物能抗血小板活化，常用来治疗冠心病等，并且有关银杏叶片提取物的药理作用，结构，功能的研究也如火如荼。
- 转录组测序概述
转录组是指由处于特定状态的组织或细胞转录的所有核糖核酸的集合。细胞功能和状态的直接描述是蛋白质组。蛋白质组学下的中心法则研究模式是基因组—转录组—蛋白质组。目前，转录组已成为研究基因表达的主要方法。目前基因表达的概念是通过表征基因表达水平来推断最终蛋白质产物的丰度。转录组测序的理论基础是通过随机取样测序，转录本的取样频率接近大样本下转录组中转录本的相对丰度。一般研究中的转录组研究主要是mRNA研究，转录组测序是近年来发展起来的高通量测序技术。转录组具有以下优点：可以直接测定每个转录片段序列和单个核苷酸的准确性，同时避免了交叉反应和背景噪声的问题，灵敏度高，可以检测细胞中复制的稀有转录本，可以对任何物种进行全基因组分析，所以在不了解物种基因信息的情况下也能够直接对任意的物种进行分析，与此同时还能够检测未知基因，发现新的转录本，并且其检测范围较广。
目前转录组测序广泛应用于木本植物中，如板栗，黑松，油茶，油桐，山茶，榆树，文冠果等植物。转录组测序也已广泛应用于银杏叶片。其中孙利民(2019年)首次对银杏叶片三个关键发育阶段的转录组、代谢组和蛋白质组进行多组SSR分析，促进了银杏叶片药用价值的开发利用。刘伟等（2018年）通过对银杏进行转录组测序，分析了银杏生长发育不同时期类黄酮生物合成关键基因的表达过程。张楠等(2013年)利用Illumina公司的基因组分析仪IIx对银杏细胞转录组进行高通量测序，发现银杏内酯和紫杉醇生物合成基因，特别是羟化酶基因。林小涵(2010年)利用454GSFLX测序平台对银杏进行转录组测序，从而研究银杏叶的基因谱。赵建国(2017年)研究了银杏不同年龄阶段血管形成层活性的转录调控。该文采用第二代高通量测序技术对雌性银杏不同年龄阶段的血管形成层进行转录测序分析，从而评价和测量银杏不同年龄阶段的生长情况。基于转录组序列的SSR标记的发展为SSR标记提供了更全面的信息和丰富的数据，也具有EST-SSR标记的优点。
- SSR分子标记概述
在广义上，分子标记指的是可遗传和可检测的DNA序列或蛋白质，而在狭义上，分子标记指的是反映个体或群体基因组中某些差异的特定DNA片段。分子标记是迄今为止最准确和最直接的遗传多样性检测方法，可用于分析任何基因片段和克服等位基因遗传标记数量的不足。常见的分子标记包括RFLP(限制性内切酶片段长度多态性标记)、RAPD(随机扩增多态性DNA标记)和AFLP(扩增片段长度多态性标记)，SSR（简单重复序列标记），ISSR（简单重复序列间扩增OSSR标记）五种，其中RFLP即限制性片段长度多态性，这是最早应用DNA分子标记的技术，其原理是利用特定的限制性内切酶对不同生物个体的基因组DNA进行识别和切割，获得不同大小的DNA片段。产生的DNA片段的数量和每个片段的长度反映了DNA分子上不同酶切位点的分布，它具有操作实验繁琐，克隆探针较困难，成本高的缺点。RAPD指的是多态性DNA的随机扩增，其特征在于快速、简单、高效、低成本和低数量的DNA供应。RAPD是一个显性标记，但它不能识别杂合子和纯合子，稳定性和重复性差。AFLP即扩增片段长度多态性，该技术兼有以上两者的优点，但费用较高，操作较复杂，对样品DNA质量要求较严格。ISSR是在SSR的基础上发展起来的一种分子标记。为了开发ISSR引物，不需要知道SSR两端的序列。ISSR引物可用于不同物种，不像SSR那样具有特异性。ISSR引物的信息含量、多态性、稳定性和重复性均高于RAPD，它比AFLP更方便、更快、成本更低，是一种极具发展前景的分子标记。
SSR分子标记，也称为DNA微卫星，是一种串联重复序列，由几个核苷酸(通常是1到6个)组成，其中最常见的是双核苷酸重复。由于串联重复的数量不同，它们具有高度的多态性，它们是串联重复序列，由数十个长度的核苷酸组成。每个SSR两端的序列一般都是相对保守的单拷贝序列。根据重复基序中核苷酸的数量，SSR标记分为单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸。基于单一类型、组合间隔类型、不同组合类型和不同组合间隔类型，核苷酸重复排列有四种类型。根据标记的来源，有三种类型：基因组、转录组SSR和表达序列标签。SSR分子标记需要的DNA量少，检测到的一般都是共显形的一个多等位基因位点，可以鉴定杂、纯合子，而且扩大了样品来源，还具有引物的通用性，同时具有成本低廉、容易操作的特点，SSR分子标记具有数量和种类丰富、分布广泛、突变率高等特点，因此在DNA指纹图谱构建、分子标记辅助育种、基因定位、遗传多样性分析等方面得到了广泛应用。
SSR标记因其高重复性而成为共显性标记，引物在种间或种内的保守性，在群体中存在大量的复等位性的特点，成为了林木中遗传多样性研究、亲缘关系的进化、交配系统和亲子鉴定和构建遗传图谱的理想工具。作为共显性分子标记，SSR分子标记已经广泛应用于各个领域，微卫星的发展已经应用于林木，如松树、杨树、桉树、果树等，并用于指纹分析、基因定位、遗传连锁图谱构建、种子纯度检测、植物群体遗传分析、植物进化和遗传多样性研究。刘永利等(2010年)通过SSR多态性分析筛选出92对引物，其中苹果SSR引物43对，苹果EST-SSR引物28对，梨SSR引物21对。实验中共产生197个等位基因，平均每个引物产生2.1个等位基因。实验首次将自主开发的苹果EST-SSR引物成功定位在梨的地图上，从而建立和完善了高密度的遗传图谱。郭树杰（2010年）总结了分子标记技术在林木种苗管理中的应用包括：快速准确的树种鉴定，苗木遗传质量检测，林木种质资源的保护和利用，树种鉴定。杨海平等(2017年)在构建遗传连锁图谱的基础上，通过QTL作图建立了数量性状和分子标记之间的关系，为基于基因图谱的克隆和分子标记辅助选择提供了理论基础。吕志华(2006年)总结说，RAPD标记可以直接检测基因组中的遗传多态性，同时完成这些多态性位点的遗传作图，为定位抗虫、抗病等性状的基因提供了框架。
4.银杏中黄酮类重要化合物的研究
银杏作为一种活化石，全身都可以被利用，银杏的研究主要是其药用价值，主要药用成分为黄酮类和萜内脂类化合物，银杏叶中黄酮类化合物含量较高，包括黄酮类化合物、黄酮醇、二氢黄酮及其糖苷、儿茶素、双黄酮等成分。目前已从银杏叶中分离到40种黄酮类化合物。黄酮类化合物广泛应用于临床，具有降血脂、降血压、治疗冠心病、心绞痛、慢性肝炎等保健作用。朱淼等（2019年）通过研究银杏叶斑病病叶中黄酮含量的变化，发现了患病程度轻的银杏叶片具有采摘再利用的价值，同时，黄酮类化合物具有较强的抑菌活性，说明黄酮类化合物含量的增加可能是银杏叶片抵抗叶斑病病原菌感染的机制之一。崔润丽等(2018年)通过设计L9(34)正交实验，以4个因素、3个水平确定银杏叶总黄酮的最佳提取条件。赵一懿等(2017年)建立了UPLC-QTOF-MS~E方法，采用超高效液相色谱法和三重四极飞行时间质谱法，实现了银杏提取物中33种化学成分的同时定量分析，包括17种黄酮醇苷、5种萜内酯、4种酚类和7种羧酸。杨利伟(2017年)等采集了不同产地和不同树龄的地被叶样品，测定了其中黄酮类化合物和内酯类化合物的含量，并研究了产地和树龄对银杏地被叶有效成分含量的影响。结果表明：不同产地银杏叶黄酮含量变化较大，且内酯含量相近；银杏叶中黄酮类化合物和内酯类化合物的含量随树龄的增加而降低。马岚(2015年)以芦丁为标准品，用紫外分光光度法和溴法测定银杏叶中总黄酮的含量，用紫外分光光度法测定总黄酮的含量。测定波长lambda;= 352海里，吸光度与浓度之间的关系是：c = 0.0195 - 0.0065，线性相关系数R = 0.9991；采用滴定分析法、溴化法测定银杏中黄酮类化合物的含量。在此条件下，一个类黄酮分子可以与5个溴分子发生反应。
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