1.文献综述
- 1 牡丹微繁殖技术研究进展
牡丹（Paeonia sect. Moutan）为芍药科芍药属落叶亚灌木，是我国特有的名贵观赏兼药用植物，至今已有 1600 余年的栽培历史[21]。近年来，牡丹种子的油用价值逐渐被发掘[22]，国务院于 2014 年颁发了《关于加快木本油料产业发展的意见》，首次把油用牡丹列为国家重点发展的木本油料作物，自此， 牡丹成为了一种集观赏、药用和食用保健于一身的重要经济植物，拥有巨大市场需求。
目前，牡丹繁殖主要采用播种、分株和嫁接[13]，繁殖效率低、周期长，无法实现规模化、规范化生产。微繁殖即植物的离体无性繁殖技术，以含有顶端分生组织的器官（顶芽、腋芽和萌蘖芽等）为外植体，于人工培养条件下解除其顶端优势诱导获得大量可供继代培养的芽，进而获得生根苗和完整植株[23]。可在短期内大量繁殖苗木，克服了传统繁殖方法的缺陷，因此采用微繁殖技术繁殖牡丹是其产业发展的必然趋势。
牡丹微繁殖技术自首次被报道以来[14]，历经30余年的研究已初步形成体系，在外植体、启动和增殖培养、生根培养和驯化移栽四个方面都取得了较大研究进展。但迄今为止，移栽成活率低仍是牡丹微繁殖中突出存在的问题，并严重限制了该技术的产业化应用[24]。牡丹试管苗移栽成活率低的主要原因在于试管苗在生根阶段发生了顶芽休眠，未解除休眠的试管苗移栽后不生长，并逐渐死亡[3]。因此，开展试管苗顶芽休眠研究是提高移栽成活率的关键，也是牡丹微繁殖技术成败的关键。
1.2 植物芽的休眠及其调控研究进展
植物休眠是植物在面对不良自然环境的条件下所选择的一种保护性生存策略，会导致植物在一定时间内对促进生长的信号感应不灵敏，并伴随着内分生组织活动停止，直到适宜的生长环境到来时，植物方能解除休眠恢复生长[26]。牡丹休眠包括暂时休眠和内休眠两种类型，以内休眠为主。暂时休眠指牡丹在夏季高温干旱季节停止生长的现象,当气温、降水等因子符合生长条件时即可自动解除;而内休眠是牡丹为适应干旱、低温的冬季而逐渐形成的习性，需一定的低温期和低温值，否则即使在适宜环境下也不会萌发[16]
内休眠的诱导是个连续的过程，伴随着一系列代谢变化，过程中受到光周期、水分、低温等多种环境因素及激素类物质的调节[10]。早期人们关于休眠诱导及解除的机制的研究多集中在激素假说及破眠剂的上[27]，直至进入21世纪，才渐渐展开生理生化方面的研究，并且多集中在芽体休眠解除过程中以及开花进程中的营养物质和内源激素变化等方面[17]。内休眠相关的性状长期被认为是多基因控制的, 其调控机制非常复杂，故此前关于内休眠机制的分子生物学研究几乎未有报道。随着近年来分子生物学技术的飞速发展，有关内休眠解除的分子机制研究也渐渐展开并深入，涉及光周期、低温、水分状况等多个方面的调控[10]，对内休眠诱导及解除相关基因的分离及功能分析将是日后长期研究的重点。
1.3 植物芽休眠的分子机制研究中常用技术和方法
转录组技术是发掘功能基因的重要途径，是基因功能及结构研究的基础和出发点[7]。相较于全基因组测序，转录组测序成本更低，测序文库制备更加简化，对材料、数据分析平台要求也更低[5]，是研究植物芽休眠的分子机制的常用技术，能够从整体水平了解植物在特定阶段的基因表达模式和功能，从而更加便利地揭示特定生物学过程的分子机制[18]。随着测序技术的飞速发展，基于PacBio 单分子实时测序技术的第三代全长转录组测序技术已成熟。全长测序无需打断拼接，直接获得包含 5#39;UTR、3#39;UTR，polyA 尾的完整转录本，从而准确分析有参考基因组物种可变剪接及融合基因等结构信息，克服无参考基因组物种转录本拼接较短、信息不完整的难题。同时还可以借助二代测序数据，进行转录本特异性表达分析，获得更加全面的注释信息[11]。
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